DNAポリメラーゼ研究におけるゲノム科学的，分子科学的アプローチの融合

DNA 聚合酶研究中基因组和分子科学方法的融合

基本信息

批准号：
15H06032
负责人：
大学保一
金额：
$ 0.92万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2015
资助国家：
日本
起止时间：
2015-08-28 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H06032/
关键词：
DNA複製突然変異ＤＮＡポリメラーゼ

项目摘要

＜Polζゲノム科学的解析に必要な分裂酵母株の作成＞リボヌクレオチドを高頻度の取り込むPolζをコードする変異遺伝子の作成に着手した．第一に，Polε，PolδとPolζのカタリティックドメインのアライメントを作成し，Polζの変異されるべきアミノ酸を特定した．その後，Polζをコードする遺伝子（rev3）をプラスミドにクローニング後，当該アミノ酸が変異した遺伝子を作成した．その遺伝子をcre-loxシステムを用いて，分裂酵母の内在のrev3遺伝子と置換した．この酵母を使用して，細胞内での変異Polζの機能を解析した結果，多少の機能低下は観察されるものの，PolζのＤＮＡ合成能は失われていないことが判明した．現在，変異PolζのＤＮＡ合成によるリボヌクレオチドの取り込み定量を行っている．今後は，この株を利用して，ゲノムワイドにPolζ合成領域の特定（Pu-seq）を行う．変異Polζ遺伝子をコードする酵母株の作成と並行して，PolζによるＤＮＡ合成が必要となる細胞株の樹立もおこなった．Polζ欠損株とPolεの機能が低減した株をかけ合せて結果，PolεとPolζの二重変異株において顕著な増殖阻害が観察された．これは，Polε変異体でゲノム中のPolζの合成領域が拡大していることを示している．よって，Polε変異体において，Polζを対象としたPu-seq実験を行い，Polζがリーディング鎖合成を担うPolεを補助する仕組みを今後検証する．＜細胞内でのPolζの１分子レベルでの観察に必要な酵母株の作成＞PALM法を用いて，Polζの細胞内１分子観察を行うため，Polζのカタリティック因子のN末端にｍEos蛍光体が結合した遺伝子の作成に着手した．現在までに，Polζ遺伝子とｍEos遺伝子が結合した配列のプラスミド上へのクローニングが完了し，現在，酵母株への導入を行っている．

<创建对POLζ基因组的科学分析所需的裂变酵母菌菌株>我们已经开始创建一个编码POLζ的突变基因，该基因经常结合核糖核苷酸。首先，我们创建了POLε，POLδ和POLζ的催化结构域的比对，以鉴定要在Polζ中突变的氨基酸。之后，将编码POLζ的基因（Rev3）克隆到质粒中，并产生了突变氨基酸的基因。使用Cre-Lox系统，将基因用裂变酵母的内源性Rev3基因代替。使用该酵母，我们分析了突变体Polζ在细胞中的功能，发现尽管观察到了某些功能下降，但Polζ合成DNA的能力并未丢失。目前，核糖核苷酸摄取取决于突变polζ的DNA合成。将来，该菌株将用于识别范围内的Polζ合成区域（PU-SEQ）。与编码突变体Polζ基因的酵母菌菌株的产生同时，还建立了需要通过POLζ合成DNA的细胞系。通过将POLζ缺陷株与POLε功能降低的应变结合，在Polε和Polζ的双突变菌株中观察到了显着的生长抑制作用。这表明基因组中POLζ的合成区域在POLζ突变体中扩展。因此，在Polε突变体中，我们将对POLζ进行PU-SEQ实验，并研究Polε支持Polε的机制，Polε支持Polε，该机制负责领先链的合成。 <创建在细胞中观察Polζ的酵母菌菌株>在单个分子水平上观察到，以便使用棕榈法观察一个细胞内分子，我们开始创建一个基因，其中Meos磷与POLζ催化因子的N末端结合。迄今为止，将POLζ和MEOS基因结合的序列克隆到质粒上，目前正在引入酵母菌菌株。