成熟分裂誘起時に特異的に出現するプロテインキナーゼの精製とMPFとの関係の解明

阐明成熟有丝分裂过程中特异出现的蛋白激酶的纯化与 MPF 之间的关系

基本信息

批准号：
61480024
负责人：
佐野清
金额：
$ 3.71万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
财政年份：
1986
资助国家：
日本
起止时间：
1986 至 1987
项目状态：
已结题

项目摘要

"卵成熟特異的プロテインキナーゼ(MーspPK)"活性の粗抽出液中での急速な活性低下を還元剤が抑えうることを昨年度見い出したが, この還元剤の作用の解明は, 精製に先立ち必要なこの酵素の安定化とホルモン作用を介したin vivoにおけるこの酵素の活性化機構の解明に極めて重要であることが予見されたので, まずこれら諸点の追究にとりくんだ. その結果以下のような諸点が明らかになった. 1.MーspPK活性の存在しない未成熟卵上清液に還元剤ジチオスレイトール(DTT)を添加すると, プロテインキナーゼ(PK)活性が当初のレベルの約3倍にまで増加し始めるが, この新たに出現するPK活性は, SH酸化剤やCa^<++>に対する感受性, cAMP依存PKの阻害剤やEGTAに対する耐性から, MーspPK活性であることが明らかになった. 細胞内のSH含量が細胞周期に伴って変動することは古くから知られており, 上記の結果は, 成熟分裂開始時におこる卵内SH基の増加反応によりMーspPK活性化の引き金が引かれる可能性を示唆している. 2.DTT添加により活性が高レベルに保たれた成熟開始卵上清液中のMーspPK活性は, Ca^<++>の添加により活性が急減する. このCa^<++>に依存した活性低下は, 各種のタンパク質分解酵素阻害剤やカルモデュリン阻害剤では抑えられないが, ホスホプロテインホスファターゼの阻害剤で抑えられた. この結果より, 卵上清液中のMーspPKの不活性化機構に, SH基の酸化によると考えられる過程に加えて, Ca^<++>のホスファターゼが関与する過程が存在することが示唆された. 3.上記の結果から, MーspPKのCa依存の不活化反応の逆反応としての活性化機構の存在が示唆されるが, この点に関し, 実際に活性化へのリン酸化反応の関与を示唆する結果を得た. 今後, この2段階活性化機構の解明と共に, 安定化条件を踏まえてMーspPKの精製を進める計画である.

去年，我们发现减少剂可以抑制粗提取物中“卵成熟特异性蛋白激酶（M-SPPK）”活性的活性快速下降。据预测，这种还原剂的作用对于稳定酶极为重要，这是在纯化之前必不可少的，并且对于通过激素作用阐明该酶在体内激活的机制，因此我们首先研究了这些点。 The results revealed the following points: 1. When the reducing agent dithiothreitol (DTT) is added to the immature egg supernatant that does not have M-spPK activity, the protein kinase (PK) activity begins to increase to about three times the original level, but this newly emerged PK activity is due to sensitivity to SH oxidizers and Ca^<++>, inhibitors of cAMP-dependent PK, and resistance to egta。已经揭示了M-SPPK活性。早就知道，细胞内SH含量随细胞周期波动，上述结果表明，在成熟分裂开始时眼内SH组增加反应可能会触发M-SPPK激活。 2。通过添加Ca^<++>，通过添加DTT来迅速降低M-SPPK在成熟引起的卵上清液中的活性。这种CA^<++> - 活性的依赖性降低不能被各种蛋白酶抑制剂和钙调蛋白抑制剂抑制，但被磷酸蛋白磷酸酶的抑制剂抑制。该结果表明，卵上清液中M-SPPK的失活机制被认为是由于SH基团的氧化。有人提出，存在涉及Ca^<++>磷酸酶的过程。 3。上述结果表明，激活机制是M-SPPK的CA依赖性失活反应的反应，在这方面，我们获得的结果表明磷酸化反应实际上在激活中起作用。将来，我们计划阐明两阶段的激活机制，并根据稳定条件进行M-SPPK的纯化。