鼻アレルギーにおけるヒスタミン分解酵素の基礎と酵素活性測定の臨床応用に関する研究

鼻过敏组胺降解酶的基础研究及酶活性测定的临床应用

• 批准号: 60480520
• 负责人: 村上 嘉彦
• 金额: $ 0.19万
• 依托单位: 山梨医科大学
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
• 财政年份: 1985
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1985 至 1986
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-60480520/
• 关键词: 鼻アレルギー; 血清ヒスタミナーゼ

1)血清histaminase活性測定法に関する検討:O-dianisidine法は100μlの試料で測定が可能であり、RIを用いぬため一般臨床検査室levelで用いることが出来る。これ迄、われわれは反応後の除蛋白のためにTCAを加えたが、時に不充分であり測定時blonkの吸光度が増加する欠点があった。種々検討の結果、(1)測定時血清を4000r.pm 5分間遠沈する。(2)反応後TCAを加える、ことで解決出来た。2)血清histaminase活性測定の臨床応用:通年性鼻アレルギー患者にchemical medator遊離阻止剤のketotifen及びtronilastの常用量を4週間以上経口投与してその前後の血清histaminase活性を測定検討した。その結果、ketotifen投与によって血清histaminase活性は有意に低下(改善)傾向を示した。tranilast投用によっても同様の傾向が得られた。3)鼻アレルギー患者血清histaminaseの性状を明らかにすべく分離精製を試みた。先ず、0.24μm millipore filterで濾過した患者血清200μlをPharmacia製FPLC systemを用いてSuperrose 12 columnにapplyし、200mM Nacl 0.1M Tris Hcl buffer.pH8.0で展開gel濾過後1.0ml×20分画した。O-dianisidine perxidase法により検討するとtube No.13のみが強いhistaminase活性を示した。妊婦の血清についても同様の結果が得られた。更にこれらhistaminase活性の認められた分画を等電点電気泳動法にて検討の結果pH6.8において最も良好な蛋白分離帯が認められたのでFPLC systemにMono Qを用いて先のhistaminase活性分画の500μlをapplyし、0.1M phosphate buffer pH6.8及び1.0M Nacl 0.1M phosphate buffer pH6.8にてイオン勾配を作製し、0.5ml×30に分画した。その結果、UV260mmにて単一のpeakを示すtube No.22のみが強いhistaminase活性を示した。

1）血清组胺酶活性测定方法研究：O-联茴香胺法可测定100μl样品，不使用RI，因此可用于一般临床实验室水平。到目前为止，我们在反应后添加TCA来去除蛋白质，但有时效果不够，并且存在测量时增加空白吸光度的缺点。各种研究的结果是，(1)测定时将血清以4000rpm离心5分钟。 (2)反应后添加TCA解决了该问题。 2）血清组胺酶活性测定的临床应用：我们给常年性鼻过敏患者口服常规剂量的化学介质释放抑制剂酮替芬和曲尼司特4周以上，并测定给药前后的血清组胺酶活性。结果，通过给予酮替芬，血清组胺酶活性趋于显着降低（改善）。曲尼司特给药也观察到类似的趋势。 3)尝试分离纯化鼻过敏患者血清组胺酶。首先，将通过 0.24 μm 微孔过滤器过滤的 200 μl 患者血清应用到使用 Pharmacia FPLC 系统的 Superrose 12 柱上，该系统使用 200 mM Nacl 0.1 M Tris Hcl 缓冲液（pH 8.0）进行显色，然后分级为 1.0 ml x 20 级分凝胶过滤后。当使用O-二茴香胺过氧化物酶法检测时，仅13号管显示出强组胺酶活性。孕妇血清也得到了类似的结果。此外，我们使用等电聚焦检查了这些级分的组胺酶活性，发现在 pH 6.8 时观察到了最佳的蛋白质分离带。应用 500μl 样品并添加 0.1M 磷酸盐缓冲液 pH6.8 和 1.0M Nacl 0.1M 磷酸盐缓冲液。在 pH 6.8 下创建离子梯度并分级成 30 x 0.5ml 体积。结果，只有在UV 260mm处显示单峰的22号管显示出强组胺酶活性。

项目成果

久松建一,山内祥正,野沢出,村上嘉彦: The Jounal of allergy and clinical Immunology.

Kenichi Hisamatsu、Yoshimasa Yamauchi、Izuru Nozawa、Yoshihiko Murakami：过敏与临床免疫学杂志。