遺伝子組換え作物に起因する遺伝子汚染の評価法に関する研究

转基因作物遗传污染评价方法研究

基本信息

批准号：
15651007
负责人：
茗荷尚史
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Musashigaoka College
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

【目的】平成15年度までに市販ダイズ加工品の89.7%から組換え遺伝子が検出されるもののその含有率は0.1%程度と、我国の消費流通過程に遺伝子組換え作物が薄く広く浸透しつつある実態を明らかにし、平成16年度は遺伝子組換え作物に起因する遺伝子汚染の実態を明らかにすべく基礎情報として、除草剤耐性組換えダイズRoundup Ready 40-3-2系統の導入遺伝子の変異出現の事実を確認し、さらにそのうちの一箇所に、表現系に影響を与える致命的なSNPが出現している可能性を指摘した。本年度は本研究の最終目的でもある遺伝子水平伝播の実証を得たので報告する。【方法】まずGMダイズRoundup Ready 40-3-2系統の栽培経験がある土壌および同GMダイズを飼料とした家畜の飼育土壌を日本各地計19箇所から採取し、細菌および真菌の分離を試みた。次に除草剤グリホサートによる選抜を繰り返し、得られたグリホサート耐性株から組換えDNAのPCR法による検出を行い、増幅断片の配列決定を行った。さらにこれら微生物株のrDNA解析をして種レベルの同定を行うとともに、昨年度作製に成功していた特異抗体を駆使して、Western-blot法による組換え遺伝子の発現解析を行った。【結果】採取土壌飼料中に生存していた9.8x10^9CFUの微生物株を対象にグリホサートによる選抜を行ったところ、51株のグリホサート耐性株を得た。これらのうち22株からGMダイズ由来の組換え遺伝子が検出された。PCR増幅断片の塩基配列はすべて決定したが、それらのうち14株の配列はGMダイズの人工的連結部位配列と完全に一致した。すなわちこの時点で遺伝子水平伝播の確証が得られた。さらにこれら14株中で組換え遺伝子が発現しているかを確かめたところ、2株で特異抗体に染色される想定サイズのバンドが観察された。これらの結果は、植物体から環境微生物への組換え遺伝子水平伝播の事実を始めて証明しただけでなく、その一部は発現していることを示している。また本研究で行ったプロセスは、除草剤によるセレクションステップを導入することにより、今まで検出できなかった超低頻度の遺伝子伝播をも評価可能とした成果であった。

[目的]截至2003财年，市场上89.7%的加工大豆产品中检测到转基因基因，但含量仅为0.1%左右，表明转基因作物正在缓慢而广泛地渗透到日本的消费分配过程中。为了澄清实际情况，并澄清转基因作物造成的基因污染的实际情况，我们在2004财年进行了抗除草剂重组大豆Roundup Ready研究作为基础资料。我们证实了40-3-2菌株转基因中出现突变，并指出其中一个菌株可能出现影响表型系统的致命SNP。今年，我们将报告我们已经获得了水平基因转移的示范，这是这项研究的最终目标。 [方法] 首先，从日本共19个地点采集种植转基因大豆Roundup Ready 40-3-2菌株的土壤和以转基因大豆为饲料饲养牲畜的土壤，分离细菌和真菌。接下来，重复使用除草剂草甘膦进行选择，并通过PCR检测所得草甘膦抗性菌株的重组DNA，并对扩增片段进行测序。此外，我们还对这些微生物菌株进行了rDNA分析，以在物种水平上进行鉴定，并利用Western-blot方法分析了重组基因的表达，充分利用了我们去年成功生产的特异性抗体。 [结果]用草甘膦筛选收集到的土壤饲料中存活的微生物菌株9.8x10^9 CFU，获得51株抗草甘膦菌株。在其中 22 个菌株中检测到源自转基因大豆的重组基因。测定了所有PCR扩增片段的核苷酸序列，其中14个片段的序列与转基因大豆的人工连接位点序列完全匹配。换句话说，此时获得了水平基因转移的确认。此外，当我们确认重组基因是否在这14个菌株中表达时，在2个菌株中观察到了用特异性抗体染色的预期大小的条带。这些结果不仅首次证明了重组基因从植物水平转移到环境微生物的事实，而且表明其中一些重组基因得到了表达。此外，通过引入使用除草剂的选择步骤，本研究中进行的过程甚至能够评估以前无法检测到的极低频基因传播。