アデノ随伴ウイルスを用いた血友病インヒビター患者に対する遺伝子治療用ベクターの開発

利用腺相关病毒开发血友病抑制剂患者基因治疗载体

• 批准号: 14657249
• 负责人: 鈴木 隆史
• 金额: $ 2.05万
• 依托单位: Tokyo Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14657249/
• 关键词: 血友病; インヒビター; アデノ随伴ウイルス; 遺伝子治療

血友病AあるいはBインヒビターの治療に用いられるリコンビナント活性型第VII因子製剤(rFVIIa)は半減期が短いことから、その一定レベルの持続的な発現がインヒビター患者の出血予防となる可能性があり、FVIIaとして細胞外へ分泌されるメカニズムを持たせた治療用ベクターのデザインに着手した。平成14年度に、遺伝子工学的操作にてヒトFVIIcDNAをAAVベースのプラスミドに組み込み、さらに、FVIIが細胞外分泌時にFVIIaとなるべく、FXがfurin/PACEによりRKRというアミノ酸配列を認識しこの部位に作用し成熟FXとなる。このことを受け、RKRをコードする9塩基をFVII重鎖-軽鎖間に挿入しベクタープラスミドを作成した。平成15年度には、本ベクタープラスミドのRKR配列をダイレクトシークエンスにて確認するとともに、発現実験に先立ち、2種類の市販の抗FVIIポリクローナル抗体を準備し、抗原量測定のためのELISAを構築した。FVIIcDNAおよびFVIIcDNAにRKR配列を組み込んだ各々2つのベクタープラスミドを大量培養純化した。HEK293細胞を6穴プレートに準備し、2μg/wellのプラスミドDNAをリポフェクション法によりトランスフェクションした。数回のトランスフェクションを試みたが、培養72時間後においても有意なFVIIタンパクの発現は得られなかった。このことは、9塩基挿入が細胞外分泌の抑制を引き起こしたことが推測された。ELISAやトランスフェクションの方法にも改良の余地があると思われ、本研究期間内において提示できる結果は得られなかったが、期間終了後も上記を考慮しつつ課題に取り組む予定である。

由于用于治疗血友病A或B抑制剂的重组活性因子VII制剂（RFVIIA）的半寿命短，因此其恒定的表达水平可能会阻止抑制剂患者出血，并且我们已经开始设计具有外部分泌为FVIIA机制的治疗载体。 2002年，通过基因工程将人FVII cDNA掺入基于AAV的质粒中，为了使FVII在细胞外分泌过程中成为FVIIA，FX识别Furin/PACE称为RKR的氨基酸序列，并在该站点上起作用，并在该站点上起作用，从而在Mature FX中作用。为此，将编码RKR的9个碱基插入了FVII重链和轻链之间，以创建载体质粒。在2003年，通过直接测序确认了该载体质粒的RKR序列，并且在表达实验之前，制备了两种商业可用的抗FVII多克隆抗体，并为测量抗原量构建了ELISA。大量培养了两个将RKR序列掺入FVII cDNA中的载体质粒和FVII cDNA。在6孔板中制备HEK293细胞，并通过LiPofection方法转染2μg/孔的质粒DNA。尽管尝试了几次转染，但即使经过72小时的培养，也无法获得明显的FVII蛋白表达。这表明9碱基插入引起了细胞外分泌的抑制。尽管似乎有改善ELISA和转染方法的余地，但在本研究期内未能获得任何结果，我们计划在此期间结束后考虑上述问题时解决问题。