骨膜細胞の多分化能およびコラーゲン遺伝子の発現と調節について- Double in situ hybridization法による解析-

骨膜细胞的多能性和胶原蛋白基因的表达和调控-双原位杂交法分析-

基本信息

批准号：
05670197
负责人：
猪山賢一
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

鶏胚椎体組織を用いた関節軟骨成長板においては急速なコラーゲン遺伝子のスイツチonとoff(II、IX型→X型)がおこり、細胞外マトリックスのダイナミックな改築が示唆されるが、本研究では、ビオチンおよびジゴキシゲニン標識各型コラーゲン遺伝子プローブを用い、鶏胚関節軟骨および異所性骨軟骨組織において一個の軟骨細胞内で二種類のコラーゲン遺伝子の転写関節がなされている軟骨細胞を螢光double in situ hybridization 法により形態学的に証明する事を目的とした。1).鶏胚椎体組織(stage 45〜46)の関節軟骨成長板における観察:椎体関節成長板の同一スライド切片上で、II型コラーゲンmRNAの局在とX型コラーゲンmRNAの局在が赤色螢光(ロータミン)と緑色螢光(FITC)の局在パターンとして明瞭に区別出来た。増殖軟骨細胞にはII型コラーゲンmRNAを肥大軟骨細胞にはX型コラーゲンmRNAが主として発現しており、その境界部の前肥大軟骨細胞内にはII型およびX型コラーゲンmRNAの両シグナルを本手法で証明した。感度に関しては従来われわれが報告してきたトリチウム標識CDNAプローブによる細胞内両遺伝子発現パターンとほぼ一致し、本法の有用性が示された。2).幼鶏骨膜移植による異所性内軟骨性骨化組織における観察:幼鶏胚骨骨膜組織の胸筋筋膜上への移植後9日目の異所性骨組織は典型的な骨組織および軟骨組織のほかに異型軟骨組織からなっていた。この異型軟骨組織では骨膜移植後早期よりX型コラーゲン遺伝子が発現しているが、double in situ hybridization 法では上記1)の椎体関節成長板にみられる様な明瞭な局在パターンは観察されず、II、X型両コラーゲンmRNAが早期より同時に骨膜細胞から軟骨細胞への分化とともに発現していた。また、典型的な肥大軟骨細胞が骨梁に接する部位ではI,X型コラーゲンmRNAの両シグナルをもつ細胞が観察され、肥大軟骨細胞から骨芽細胞への移行を示すphenotypeの存在が示唆された。3).一個の軟骨細胞内に複数のmRNAを同時に観察する事が可能であり、内軟骨性骨化過程の分子レベルの形態学において、本研究の応用性がさらに広まっていくものと考えられる。

在使用鸡胚椎体组织的关节软骨生长板中，发生胶原蛋白基因的快速切换（II型、IX型→X型），这表明细胞外基质的动态重塑在这里，我们使用生物素和地高辛标记。每种类型的胶原蛋白基因探针可双荧光检测鸡胚关节软骨和异位骨软骨组织中的软骨细胞，其中两种类型的胶原蛋白基因在单个软骨细胞内转录。目的是利用原位杂交方法从形态学上证明它。 1).鸡胚椎体组织关节软骨生长板的观察（45-46期）：在椎体关节生长板的同一张玻片上，确认了II型胶原mRNA和X型胶原mRNA的定位可以清楚地区分红色荧光（罗胺）和绿色荧光（FITC）的局部图案。已证实，增殖软骨细胞主要表达II型胶原mRNA，肥大软骨细胞主要表达II型胶原mRNA。在灵敏度方面，我们之前报道的氚标记cDNA探针在细胞中的两种细胞内基因的表达模式几乎相同，证明了该方法的有用性。 2）幼鸡骨膜移植异位软骨内骨化组织的观察：幼鸡胚骨骨膜组织移植到胸肌筋膜上9天后，异位骨组织类似于典型的骨骼，除组织外还含有非典型软骨组织。和软骨组织。在这种非典型软骨组织中，X型胶原基因在骨膜移植后早期表达，但双原位杂交方法没有显示出如上述1)、II型和椎体关节生长板中所见的清晰的定位模式。 X型胶原mRNA在骨膜细胞分化为软骨细胞的早期阶段就同时表达。此外，在典型的肥大软骨细胞与小梁骨接触的区域中观察到具有I型和X型胶原mRNA信号的细胞，这表明存在指示从肥大软骨细胞向成骨细胞转变的表型。 3).可以同时观察单个软骨细胞内的多个mRNA，我们相信该研究的适用性将进一步扩大在软骨内骨化过程的分子水平形态学方面。