核酸4重鎖構造をベースにした核酸性イオンチャネルの創製

基于核酸四链体结构的核酸离子通道的创建

• 批准号: 19657034
• 负责人: 片平 正人
• 金额: $ 2.37万
• 依托单位: Yokohama City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19657034/
• 关键词: 4重鎖; 核酸; イオンチャネル; リポソーム; 蛍光顕微鏡; 立体構造; 4重鎖; 核酸; イオンチャネル; リポソーム; 蛍光顕微鏡; 立体構造

リポソームに4重鎖構造を形成させた核酸を埋め込み、これがイオンチャネルとして動作するのかを検証した。検証には以下の3つの手法を用いた。(1)蛍光顕微鏡を用いた検証ジャイアントリポソームの内側にカルシウムイオンとその蛍光性指示薬であるFura2を封入した。蛍光顕微鏡でFura2の蛍光強度を追跡する事で、4重鎖を通じたカルシウムイオンの流出の有無を検証した。15分程度での蛍光強度の減少が観測され、4重鎖核酸がチャネルとして動作する事が示唆された。(2)イオン特異的電極を用いた検証リポソーム内にカリウムイオンを封入し、これをカリウムイオンを含まない溶液に移した。カリウムイオンに特異的な電極を用いて溶液中のカリウムイオン濃度をモニターする事で、4重鎖を通じたカリウムイオンの流出の有無を検証した。数秒程度及び15分程度の2つの時間領域において容液のカリウムイオン濃度の上昇が観測され、4重鎖核酸がチャネルとして動作する事が示唆された。(3)蛍光分光器を用いた検証リポソーム内のカリウムイオン濃度とpHと外液より高く決定する。また蛍光性pH指示薬であるHPTSも同時にリポソーム内に封入する。ここにプロトンイオノフォアであるCCCPを添加する。この時、カリウムイオンの流出とプロトンの流出がカップルして生じれば、リポソーム内のpHが低下し、それがHPTSの蛍光変化(減少)として観測されると予想される。CCCP添加時のHPTSの蛍光強度を蛍光分光器でモニターする事によって、4重鎖を通じたカリウムイオン流出の受けを検証した。数秒程度及び15分程度の2つの時間領域において蛍光強度の減少がされ、4重鎖核酸がチャネルとして動作する事が示唆された。以上の(1)〜(3)の検証より、4重鎖核酸がイオンチャネルとして動作する可能性が示唆された。今後は4重鎖以外の核酸を用いて同様の実験を行う事で、この可能性をさらに検証していく予定である。

我们用形成脂质体形成的四链体结构的核酸嵌入核酸，并测试了这是否充当离子通道。使用以下三种方法进行验证：（1）使用荧光显微镜钙离子及其荧光指示剂fura2验证封装在巨型三倍体内。通过使用荧光显微镜跟踪Fura2的荧光强度，验证了通过四链体的存在或不存在钙离子外排。大约15分钟后观察到荧光强度的降低，这表明四链体核酸充当通道。 （2）使用离子特异性电极钾离子进行验证，将其封装在脂质体中，并将​​其转移到不含钾离子的溶液中。通过使用特定于钾离子的电极监测溶液中钾离子的浓度，验证了通过四链体链的钾离子外排的存在或不存在。在两个时域中观察到体积溶液中钾离子浓度的升高，范围从几秒钟和15分钟的时间内，表明四链体核酸充当通道。 （3）使用荧光光谱仪进行验证：确定脂质体，pH和高于外部溶液中钾离子的浓度。另外，HPTS是一种荧光pH指示剂，也封装在脂质体内。在这里，添加了质子离子载体CCCP。目前，如果钾离子和质子的外排以多种方式出现，则脂质体内的pH值将减少，并且预计将观察到HPT的荧光变化（减少）。通过荧光光谱仪监测添加CCCP后HPT的荧光强度，以验证钾离子外排在四链链链中暴露。荧光强度在两个时域中降低，大约几秒钟和大约15分钟，这表明四链体核酸充当通道。上述验证（1）至（3）表明四链体核酸可能充当离子通道。将来，我们计划通过使用四链体以外的其他核酸进行类似的实验来进一步验证这种可能性。