カルモジュリノパチーの病態解明と核酸医薬を用いた新規治療法の開発

阐明钙调蛋白病的病理学并开发使用核酸药物的新疗法

基本信息

批准号：
20K17116
负责人：
山本雄大
金额：
$ 2.75万
依托单位：
National Cardiovascular Center Research Institute
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

vivoモデルの確立を目指しCALM遺伝子関連不整脈疾患モデルマウスの作成に取り組んだ。CALM2-E46K変異（カテコラミン誘発性心室頻拍モデル）、D134H変異（QT延長症候群モデル）のノックインマウス作成をCRISPR-Cas9システムを用いたゲノム編集により実施した。1度目の実施ではそれぞれ150個の受精卵を用いてエレクトロポレーションを行い、産子数はそれぞれE46K変異で0匹、D134H変異で3匹であった。この結果よりCALM2遺伝子は胚発生や個体発生に大きく影響していることが示唆された。使用する受精卵の数やssODN（一本鎖オリゴ）等に変更を加え、3度目の実施により、D134H変異、E46K変異ともに目的の点突然変異が存在するアレルを持ったマウスを得ることができた。今後は、得られたノックインマウスの交配をすすめるとともに、表現型の解析を行う予定である。CALM2-N98S変異を持つ患者は運動負荷によりQT延長や失神を来す症例が複数報告されており、この臨床症状はKCNQ1がコードする緩徐活性型遅延整流性K電流（IKs）の異常を原因とするQT延長症候群１型（LQT1）と同様であることに着目し、患者由来iPS 細胞を用いた実験を行った。運動負荷を再現した実験（イソプロテレノール負荷）において活動電位持続時間の短縮率が健常人由来のコントロールと比較して優位に小さいことを明らかにした。これはパッチクランプ法におけるIKs電流の解析により、運動負荷等のβ刺激に対するIKsチャネルの反応が変異カルモジュリンによって障害されているためであると考えられる。また、N98S変異カルモジュリンはL型Caチャネル電流（IcaL）の不活性化を障害することが既に報告されているが、イソプロテレノール負荷時においても同様のIcaLの不活性化障害が引き起こされていることを明らかにした。

我们致力于创建一个平静的基因相关心律不齐模型小鼠，以建立一个体内模型。通过使用CRISPR-CAS9系统编辑基因组编辑，为CALM2-E46K突变（Catecholamine诱导的心室心动过速模型）和D134H突变（长QT综合征模型）创建了敲门型小鼠。在第一届会议中，使用150个受精卵进行电穿孔，分别具有0个E46K突变和3个D134H突变。这些结果表明，CALM2基因对胚胎发育和发作有重大影响。通过更改所使用的受精卵数量，SSODN（单链寡核）等，并在第三次执行过程中，小鼠能够获得等位基因，其中D134H和E46K突变都包含目标点突变。将来，我们将促进获得的敲入小鼠的交配并分析表型。在Calm2-N98S突变的患者中，由于运动负荷引起的QT延长或晕厥，已经报道了几种病例，我们专注于与长QT综合征1型（LQT1）相似的临床症状，这是由慢激活，延迟的kisrents（IKS）使用KCNQ1和实验的慢速激活，延迟延迟的k courner（IKS）引起的。在重现运动负荷的实验中（异丙肾上腺素负荷），据表明，动作势持续时间的减少主要小于健康人的对照。这被认为是因为基于对斑块夹方法中IKS电流的分析，突变体钙调蛋白对IKS通道对β刺激的反应（例如运动负荷）受到了损害。此外，据报道，N98S突变体钙调蛋白会损害L型CA通道电流（ICAL）的失活，但已经发现，即使加载异丙肾上腺素也会引起类似的ICAL失活。