標的化レトロウイルスベクターの開発

靶向逆转录病毒载体的开发

• 批准号: 18659046
• 负责人: 天沼 宏
• 金额: $ 1.73万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18659046/
• 关键词: ドラッグデリバリー; 遺伝子治療; レトロウイルスベクター; 標的化ベクター; マウスレトロウイルス; エンベロープ蛋白質

in vivo遺伝子治療では治療用遺伝子デリバリーの標的化が不可欠である。私はリガンド・エンベロープ蛋白質(Env)キメラ蛋白質を利用した標的化デリバリー可能なレトロウイルスベクター作製の一般的方法論の確立を目標とし、すでに先駆的な成功例を報告した。本研究においてはマウスエコトロピックレトロウイルスEnvの代わりにポリトロピック(MCF型)レトロウイルスEnvをキメラ蛋白質作成に用い、標的化デリバリーの遺伝子導入タイターの改善を目指した。フレンドMCFウイルスゲノムDNA分子クローンを用いて、SDF-1αリガンドを挿入したキメラEnv発現プラスミド4種と、非キメラ型Env発現プラスミドとを構築した。SDF-1αリガンド(68アミノ酸)はEnv膜表面ユニットの可変領域A内の4か所(アミノ酸83-84、90、95、および99-101)のいずれかに挿入された。53種類のEnvの1つを持ち、E.coli LacZを発現するレトロウイルスベクターの産生にはTELCeB6細胞を用いた。非キメラ型Envを持つベクターはマウスとミンク由来の細胞に遺伝子導入しポリトロピズムを示したが、導入タイターは10^2-10^3 CFU/mlと非常に低レベルでヒト由来細胞(HOSやNP2)には遺伝子導入しなかった。SDF-1αキメラEnv発現プラスミドを用いて得た4種のレトロウイルスベクターはSDF-1αの膜受容体であるCXCR4を過剰発現するHOSやNP2細胞に遺伝子導入しなかった。非キメラ型Env発現プラスミドをTELCeB6細胞に導入し一過性の発現を調べたところ、Env前駆体が検出されるが、その量は期待される量の1/10以下であった。以上より、5種類のEnvは正しく構築されているがTELCeB6細胞内での発現が極めて悪く、標的化遺伝子導入に必要なレベルのキメラEnvを持つウイルスベクターが産生されないと考えられる。

靶向治疗基因递送对于体内基因治疗至关重要。我的目标是建立一种通用方法，用于构建能够使用配体包膜蛋白（Env）嵌合蛋白进行靶向递送的逆转录病毒载体，并且已经报告了开创性的成功。在本研究中，我们使用多向性（MCF型）逆转录病毒Env代替小鼠共向性逆转录病毒Env来创建嵌合蛋白，旨在提高靶向递送的基因转移滴度。使用Friend MCF病毒基因组DNA分子克隆构建了四种插入了SDF-1α配体的嵌合Env表达质粒和非嵌合Env表达质粒。 SDF-1α配体（68个氨基酸）插入Env膜表面单元可变区A内的四个位置（氨基酸83-84、90、95和99-101）之一。 TELCeB6 细胞用于产生逆转录病毒载体，该载体携带 53 个 Env 之一并表达大肠杆菌 LacZ。具有非嵌合Env的载体在导入小鼠和水貂来源的细胞时表现出多向性，但导入效价非常低，为10^2-10^3 CFU/ml，并且人源细胞（HOS和NP2）未转染基因。使用SDF-1α嵌合Env表达质粒获得的四种逆转录病毒载体没有将基因引入过表达CXCR4（SDF-1α的膜受体）的HOS或NP2细胞中。当将非嵌合Env表达质粒引入TELCeB6细胞并检查瞬时表达时，检测到Env前体，但量小于预期量的1/10。综上所述，虽然已经正确构建了五种类型的Env，但它们在TELCeB6细胞中的表达极差，并且认为无法产生具有靶向基因转移所需水平的嵌合Env的病毒载体。