レーザー法を用いた植物への形質転換葉緑体の導入技術の開発

利用激光法将转化叶绿体导入植物的技术开发

基本信息

批准号：
18656244
负责人：
新名惇彦
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Nara Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

葉緑体ゲノムは植物の葉の細胞あたり約1万コピー存在し、これに外来遺伝子を導入すればgenedosage効果が期待でき、植物の劇的な改変が可能である。現在、葉緑体の形質転換は葉緑体が発達している緑葉に遺伝子銃でベクターを導入するが主流であるが、緑葉からカルス誘導・個体再生の系が使えるのはタバコ、レタス、ジャガイモなど数種の植物に限定されている。本研究では、再生が容易なカルスにレーザー加工技術により細胞壁を部分的に除去したスフェロプラスと、インビトロで外来遺伝子を導入した葉緑体を包摂したリポソームをレーザー照射により融合させ、容易に形質転換葉緑体をもつ植物体を得る普遍的な技術の開発を目的とする。昨年度までにタバコ、Nicotiana tabacum SR1細胞にUVレーザーを0.1秒間照射すると細胞膜に径数μmの穿孔が可能な条件を決定した。しかし、これでは細胞膜にも損傷を与え、細胞内容物が漏出した。今年度は0.7Mマンニトールを含む高張液にカルスを30分間浸漬し、顕微鏡下で原形質を分離を確認し、細胞膜から離れた細胞壁にレーザー照射し穿孔後、等張液に戻すことにより、細胞質成分の流出を防ぎ、かつ再増殖が可能であった。細胞集塊が大きければ再増殖効率は高いが、多くの細胞を的確に穿孔するには細胞数が少ない集塊を用いることが望ましい。そこでGFP遺伝子を導入したカルスをペクトリアーゼで処理し、10細胞程度の細胞小集塊にし、高張液処理、レーザー穿孔、等張液懸濁後、LS培地での再増殖を検討した。細胞小集塊は再増殖しなかったので、GFP遺伝子を導入していないタバコ細胞をナース細胞として用いたところ、増殖効率は低いがGFP遺伝子導入細胞が増殖することが確認された。基本技術の一部が出来たので、今後のレーザーマニュピレーターで葉緑体を導入する段階に至った。

在植物的叶片中，每个细胞中大约有10,000份叶绿体基因组副本，如果将外源基因引入其中，则可以预期基因效应，从而可以对植物进行巨大的修饰。当前，叶绿体转化是主流，但是向量被引入绿叶中，其中使用基因枪来开发叶绿体，但是使用绿叶的愈伤组织诱导和个体再生系统的唯一方法是将植物植物，例如多种植物，例如烟草，生菜和土豆。这项研究旨在开发一种通用技术来融合护层，这些技术通过激光加工技术部分清除了细胞壁，这些技术易于再生，并且脂质体含有含有激光辐射的叶绿体的脂质体，以轻松地获得具有转化叶绿体的植物。直到去年直到去年，就确定了烟草和烟草tabacum SR1细胞用紫外线激光辐射0.1秒，则可以用直径为几个μm的直径将细胞膜穿孔。但是，这也损坏了细胞膜并导致细胞含量泄漏。今年，愈伤组织浸入含0.7m甘露醇的高渗溶液中30分钟，血浆在显微镜下分离，在激光照射到远离细胞膜的细胞壁后，将细胞壁穿孔，并将细胞返回到同型溶液中，以防止异含量溶液，以防止细胞质构成和重复使用。较大的细胞簇具有较高的增殖效率，但是希望使用少量细胞的簇准确地穿孔许多细胞。因此，用GFP基因引入的愈伤组织用果胶酶处理，并将其转化为约10个细胞的小簇，并在用高渗液体，激光穿孔和同量液体的悬浮液处理后，研究了LS培养基中的愈伤组织。由于小细胞簇没有重新裂解，因此，当未用GFP基因转染的烟草细胞被用作护士细胞时，尽管生长效率较低，但已确认GFP基因转染的细胞增殖。通过创建了一些基本技术，我们已经到达了使用未来的激光操纵剂引入叶绿体的阶段。