Sox遺伝子の導入による変形性関節症の治療に関する先駆的研究

引入Sox基因治疗骨关节炎的开创性研究

基本信息

批准号：
16659416
负责人：
福井尚志
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Clinical Research Center for Allergy and Rheumatology, National Hospital Organization, Sagamihara National Hospital
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究に先立って、変形性関節症における遺伝子発現をレーザー・マイクロダイセクションと定量的PCRにより詳細に調べたところ、従来の報告と合致して軟骨変性部表層において軟骨基質の成分であるII型コラーゲン、アグリカンの発現が低下していることが確認された。ついで本研究において病変部軟骨細胞への導入を予定したSox9の発現を調べたところ、この発現は予想に反して軟骨変性部でも低下しておらず、この部位での軟骨基質の発現減少はSox9の発現レベルと連動せずに生じていることが明らかとなった。この一見矛盾する現象が生じる理由として(1)Sox5,Sox6などSox9と協調的に働く分子の発現の変化、(2)Sox9の細胞内局在の変化、(3)Sox9以外の系によるマトリクス分子発現の転写レベルでの抑制、などの可能性が考えられる。この結果から今回の研究で予定していたSox9の導入によるOAの治療の試みは合理性に乏しいと考えられたため、研究の主眼を軟骨病変の研究において必須かつ必要な技術である軟骨基質中の軟骨細胞に対する遺伝子導入法の開発に切り替えることとした。この実験については、当初器官培養により維持された軟骨片の内部の軟骨細胞に対する遺伝子導入をアデノウイルスベクターを用いて試みた。結果としてこの方法では培養軟骨片のごく表層の細胞においてわずかな遺伝子の導入が観察されただけで、軟骨基質に包埋された細胞にはこの方法では導入が困難であると考えられた。ついでelectroporation法を試みた。最近Amaxa社から発売されたNucleofectorRは一次培養軟骨細胞に対しては非常に効率よく遺伝子を導入することが可能であり、我々自身も実際にこれを確認している。この方法を用いて基質内の軟骨細胞に対してGFP発現ベクターの導入を種々の条件下に試みたが、結果として成功しなかった。この一因はプラスミドが比較的分子量の大きな分子であり、物理的に軟骨基質内に浸透しにくいこと、さらに軟骨基質が多量のプロテオグリカンを含んで負に帯電しており、プラスミドの進入を電気的にも阻害することにあると考えられた。引き続いて現在も皮膚などにおいてマトリクス内の線維芽細胞に対して遺伝子導入が可能と報告されているparticle bombardment (gene gun)の方法を試みている。

在这项研究之前，我们利用激光显微切割和定量PCR详细研究了骨关节炎中的基因表达，发现II型是软骨退变表层软骨基质的组成部分，与之前的报道一致，证实了这一点。胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的表达降低。接下来，在本研究中，我们调查了计划导入病变软骨细胞中的Sox9的表达，结果发现，与预期相反，即使在软骨退变区域，该表达也没有减少。这与的表达水平无关。这种看似矛盾的现象的原因是（1）与Sox9配合的分子表达的变化，例如Sox5和Sox6，（2）Sox9的细胞内定位的变化，以及（3）由其他系统引起的基质分子Sox9 的可能性包括抑制转录水平的表达。基于这一结果，本研究中计划通过引入Sox9来治疗OA的尝试被认为是不合理的，因此研究的主要重点是我们决定转而开发软骨细胞的基因转移方法。对于这个实验，我们最初尝试将基因引入使用腺病毒载体通过器官培养维持的软骨片内的软骨细胞中。结果，通过该方法，在培养的软骨片的最表层的细胞中仅观察到少量的基因导入，并且认为将基因导入到嵌入软骨的细胞中是困难的。使用这种方法的矩阵。接下来，我尝试了电穿孔方法。 Amaxa 最近发布的 NucleofectorR 能够非常有效地将基因导入原代培养的软骨细胞中，我们自己也确实证实了这一点。我们尝试使用这种方法在各种条件下将 GFP 表达载体引入基质内的软骨细胞，但没有成功。造成这种情况的原因之一是质粒的分子量比较大，物理上很难渗透到软骨基质中。而且软骨基质中含有大量的蛋白聚糖，且带负电荷，使得质粒很难进入软骨基质。人们认为这也可能抑制软骨基质。随后，我们目前正在试验粒子轰击（基因枪）方法，据报道该方法能够将基因引入皮肤基质内的成纤维细胞中。