西ナイルウイルスおよび日本脳炎ウイルスに対する動物用経口ワクチンの研究開発

西尼罗河病毒和乙脑病毒动物口服疫苗的研发

• 批准号: 16658121
• 负责人: 只野 昌之
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: University of the Ryukyus
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16658121/
• 关键词: 粘膜免疫; E型肝炎ウイルス; DNAワクチン; 節足動物媒介性ウイルス; 人獣共通感染症; バキュロウイルス発現系; 経口ワクチン; 経鼻ワクチン; 西ナイルウイルス; 日本脳炎ウイルス; バキュロウイルス; VLP; 経口免疫

E型肝炎ウイルス(HEV)のウイルス様中空粒子(HEV-VLPs)を発現する組換えバキュロウイルスを接種した高発現蛾由来細胞株Tn5の感染培養上清中のHEV-VLPsをポリエチレングリコール(PEG)法あるいは超遠心法にて濃縮し、さらにショ糖密度勾配超遠心法にて精製した。精製HEV-VLPsにジチオスレイトール存在下でEGTAを添加して構成蛋白単位に開裂せしめ、既に作製済みの西ナイルウイルスおよび日本脳炎ウイルスに対するDNAワクチン候補とカルシウムイオンを添加してDNAワクチンを封入したHEV-VLPsを再構築させた。超遠心法で濃縮したDNAワクチン封入HEV-VLPsを培養細胞(ヒト大腸癌由来Caco-2株、ヒト咽頭癌由来HEp-2株)に接種し、酵素抗体法による検討で細胞内にDNAワクチンに由来する目的蛋白質の発現を確認した。これまでの検討で、感染培養液からのHEV-VLPs濃縮には超遠心法がロスも少なく、PEG法より優れていることがわかった。しかし、超遠心法による濃縮・精製では、一度に扱える感染培養上清量が制限される上に操作が煩雑なので、マウスを用いた免疫実験に必要な量のHEV-VLPsを得るための大量調整には簡便且つ迅速に大量の原料を扱える方法が必要である。そこで、ヒスチジンとアスパラギン(H-N)の繰り返し配列を持つHEV-core蛋白を発現する組換えバキュロウイルスを再構築し、H-N繰り返し配列に対する親和性を利用したアフィニティクロマトグラフィーにより、大量の感染培養上清からHEV-VLPsを精製する方法に切り替えた。

用聚乙二醇（PEG）处理高表达的蛾源性细胞系Tn5的感染培养物上清液中的HEV-VLP，该细胞系接种了表达戊型肝炎病毒（HEV）的病毒样空心颗粒（HEV-VLP）的重组杆状病毒。使用方法或超速离心法对其进行浓缩，并使用蔗糖密度梯度超速离心法进一步纯化。在二硫苏糖醇存在下，将EGTA添加到纯化的HEV-VLP中，将其裂解成组成蛋白单元，以及已经生产的西尼罗河病毒和日本脑炎病毒的DNA疫苗候选物，并添加钙离子以封装DNA疫苗HEV-VLP 被重构。将超速离心浓缩的封装有 DNA 疫苗的 HEV-VLP 接种到培养细胞（人结肠癌来源的 Caco-2 株、人咽癌来源的 HEp-2 株）中，酶联抗体检测显示该 DNA 疫苗是证实了衍生的靶蛋白的表达。既往研究表明，超速离心法从感染培养液中浓缩HEV-VLPs优于PEG法，且损失较少。然而，使用超速离心的浓缩和纯化限制了一次可处理的感染培养物上清液的量并且需要复杂的操作，因此需要一种能够简单且快速地处理大量原材料的方法。因此，我们重建了表达具有组氨酸和天冬酰胺（H-N）重复序列的HEV核心蛋白的重组杆状病毒，并使用亲和层析，利用对H-N重复序列的亲和力，从病毒中提取大量感染的培养物上清液。我们转而采用纯化HEV-VLP的方法。