酵母の形質転換(DNA輸送)機構の解明

阐明酵母转化（DNA运输）机制

• 批准号: 16658037
• 负责人: 村田 幸作
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16658037/
• 关键词: 形質転換; DNA輸送; 酵母; S.cerevisiae; エンサドイトシース; YOYO-1; Nanogold; Pan1p; 非必須遺伝子欠損株; 形質転換能; DNA取り込み; arp2; 3複合体; エンドサイトーシス; クラスリン; アクチン; 形質転換; DNA輸送; 酵母; S.cerevisiae; エンサドイトシース; YOYO-1; Nanogold; Pan1p; 非必須遺伝子欠損株; 形質転換能; DNA取り込み; arp2; 3複合体; エンドサイトーシス; クラスリン; アクチン

本研究では、酵母の形質転換(DNA輸送)機構の更に詳細な知見を得るため、形質転換プロセスの可視化を行った。また、本DNA輸送において重要な役割を果たすと予想されるPan1pの機能解析も試みた。標識試薬YOYO-1はDNAと強く結合し、かつDNAと結合したときのみ蛍光を発する。しかも、YOYO-1は細胞膜を通過しない。本研究では、YOYO-1で標識したDNA(YOYO-1/DNA)を用いて酵母細胞の形質転換を行い、同複合体を蛍光顕微鏡で追跡した。その結果、最初にYOYO-1/DNAが酵母細胞壁周辺を染色する様子が観察された。更に詳細な情報を得るため、Nanogoldで標識したDNA(Nanogold/DNA)を用いて、電子顕微鏡により観察したところ、Nanogold/DNAが細胞壁周辺に結合していた。これは、蛍光顕微鏡による観察結果と一致した。更に、Nanogold/DNAが細胞壁内、細胞膜周辺、及び細胞内にも観察された。特に、Nanogold/DNAが細胞膜の陥入に伴い、エンドサイトーシス様の細胞膜陥入、即ち「超チャネル」により細胞内に取り込まれる様子を観察することに成功した。酵母「超チャネル」の分子機構を明らかにするため、本「超チャネル」において重要な役割を果たすと予想されるPan1pに着目した。Pan1pは、多様なドメインから構成され、各ドメインが多くのエンドサイトーシス(細胞膜陥入)因子と相互作用する。従って、Pan1pにおいて、細胞膜陥入と形質転換に必須の領域を明らかにすることにより、Pan1pを介した細胞膜陥入過程の詳細な知見が得られると期待した。本研究では、少なくともPanlp生育必須領域が細胞膜陥入と形質転換に必須の領域であることを明らかにした。

在这项研究中，我们可视化转换过程，以获得有关酵母中转化机理（DNA传输）的更详细的知识。我们还试图分析PAN1P的功能，这预计将在DNA传输中发挥重要作用。仅在与DNA结合时，标记试剂yoyo-1才与DNA强烈结合并荧光。此外，Yoyo-1不会通过细胞膜。在这项研究中，使用Yoyo-1标记的DNA（Yoyo-1/DNA）转化酵母细胞，并通过荧光显微镜跟踪复合物。结果，观察到Yoyo-1/DNA首先染色了酵母细胞壁周围的区域。为了获得更详细的信息，当使用用纳米质量（纳米/DNA）标记的DNA观察到电子显微镜时，Nanogold/DNA发现纳米元/DNA与细胞壁结合。这与荧光显微镜观察结果一致。此外，还观察到纳米/DNA在细胞壁，细胞膜周围和细胞内观察到。特别是，我们成功地观察到了如何通过内吞作用样细胞膜内陷（即“超通道”）在细胞中吸收纳米/DNA。为了阐明酵母“超级通道”的分子机制，我们专注于PAN1P，这将在此“超通道”中发挥重要作用。 PAN1P由多种域组成，每个结构域都与许多内吞（细胞膜内陷）因子相互作用。因此，希望通过阐明PAN1P中细胞膜内陷和转化必不可少的区域，可以获得通过PAN1P对细胞膜内陷过程的详细知识。这项研究表明，至少PANLP生长的基本领域是细胞膜内陷和转化必不可少的区域。