疾患感受性ハプロタイプを検証する為の新規BACトランスジェニック手法の開発

开发一种新的 BAC 转基因方法来验证疾病易感性单​​倍型

• 批准号: 16651102
• 负责人: 大塚 正人
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Tokai University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16651102/
• 关键词: gene targeting; Transgenic mouse; association study; single copy Tg; chosen locus; ES cell; recombineering; RMCE; Bacterial Artificial Chromosome(BAC); homologous recombination; ET cloning; haplotype

recombineering法を用いたターゲティングベクター(TV)作製とBACクローン改変を簡便に行う為に、独自のベクターを開発した。またE14系ES細胞を用いたTV作製に使用可能な整列化BACライブラリーのPCRスクリーニング系を確立した。これらのリソースを用いていくつかのTVを作製し、実際にターゲティングマウスを作製した。そのうちの一つであるH2-T3遺伝子領域へ導入したコンストラクトは、FRT-Ppgk-neo-変異loxP-IRES-ECFP-pA-lox2272の構造をしており、Recombinase-mediated cassette exchange (RMCE)法を用いて、この領域に目的のコンストラクトをシングルコピーで導入することが可能となるよう設計されている。そこで、実際に11kb程のコンストラクトの導入効率をES細胞内で検証した。その結果、約40%のクローンが目的の組換え体であることを確認した。本手法は非常に効率の良いものであるため、今後改変BACクローンでその効率を比較検討する予定である。必要なベクターは既に開発済みである。また、上記コンストラクトをROSA26座位に導入したES細胞も得ている。実際に遺伝子導入のターゲットとする領域は、相関解析に基づく疾患感受性候補領域を想定しているが、これまで行ってきたゲノムワイドな相関解析により、慢性関節リウマチ、尋常性乾癬の候補領域をいくつか同定している。今年度は、これらの領域をさらに絞り込んだが、その中から尋常性乾癬の感受性遺伝子として有望な候補遺伝子であるCDSN遺伝子に注目し、まずはその過剰発現Tgマウスを作製した。その解析は今後の課題である。

为了使用重组方法轻松创建定位向量（TV）并修改BAC克隆，我们已经开发了自己的向量。此外，还建立了用于使用E14 ES细胞进行电视生​​产的对齐BAC库的PCR筛选系统。使用这些资源，生成了几台电视，并实际生产了靶向小鼠。其中之一是引入H2-T3基因区域的构建体是FRT-PPGK-NEO突变的Loxp-ires-eCFP-PA-PA-LOX-LOX2272的结构，旨在允许使用重组酶 - 介导的Cassette Exchange（RMCE）方法使用重组酶 - 介导的单个副本进入该区域。因此，我们已经验证了ES细胞中约11 kb的构建体的转移效率。结果，已经确认约有40％的克隆是感兴趣的重组者。该方法非常有效，我们计划将来比较和检查改良的BAC克隆的效率。所需的向量已经开发。此外，还获得了在ROSA26基因座中引入上述构建体的ES细胞。基于相关分析，假定基因转移的实际靶向区域是易感候选区域，但到目前为止，已经进行了全基因组的相关性分析，已经确定了几个用于类风湿关节炎和斑块牛皮癣的候选区域。今年，我们进一步缩小了这些区域，我们首先创建了过表达的TG小鼠，重点是CDSN基因，CDSN基因是一种有前途的候选基因，用于易感斑块牛皮癣。分析是未来的问题。

项目成果

Construction of mouse 129/Ola BAC library for the targeting experiments using E14 embryonic stem cells.

使用E14胚胎干细胞构建小鼠129/Ola BAC文库用于靶向实验。

• 期刊: Genes Genet Syst. (in press)
• 作者: Ohmi Y.;Sato M.;Ohtsuka M;Ohtsuka M. et al.;Matsuzaka et al.;Ohtsuka M. et al.
• 通讯作者: Ohtsuka M. et al.

Identification and characterization of novel variants of the thioredoxin reductase 3 new transcript 1 TXNRD3NT1

• DOI: 10.1007/s00335-004-2416-y
• 发表时间: 2005-01-01
• 期刊: MAMMALIAN GENOME
• 影响因子: 2.5
• 作者: Matsuzaka, Y;Okamoto, K;Inoko, H
• 通讯作者: Inoko, H

リコンビニアリングコンストラクト、及びジーンターゲティングコンストラクト作製用ベクター

用于产生重组工程构建体和基因靶向构建体的载体

• 发表时间: 2005

Direct subcloning of target region from BAC insert using restriction enzymes that produce non-identical cohesive ends

使用产生不相同的粘性末端的限制性内切酶直接亚克隆 BAC 插入片段的目标区域

• 发表时间: 2004
• 期刊: Nucleic Acids Symp Ser. 48
• 作者: Ohmi Y.;Sato M.;Ohtsuka M
• 通讯作者: Ohtsuka M

Usefulness of repeated GenomiPhi, a phi29 DNA polymerase-based rolling circle amplification kit, for generation of large amounts of plasmid DNA.

重复 GenomiPhi（一种基于 phi29 DNA 聚合酶的滚环扩增试剂盒）可用于生成大量质粒 DNA。

• 发表时间: 2005
• 期刊: Biomol Eng. 22
• 作者: Sato M.;Ohtsuka M.;Ohmi Y.
• 通讯作者: Ohmi Y.