ヒト歯根膜DNAチップを用いた根尖性歯周炎の遺伝子病態解析

利用人牙周膜DNA芯片进行根尖周炎的遗传病理学分析

• 批准号: 15659454
• 负责人: 北村 正博
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15659454/
• 关键词: DNAマイクロアレイ; 根尖性歯周病; 歯根膜細胞; 炎症性サイトカイン; 根尖性歯周炎

1)ヒト歯根膜DNAチップの作製当研究室において単離・同定して冷凍保存されているヒト歯根膜組織3'末端cDNAライブラリの遺伝子クローン約1500個を、pUC119ライブラリベクター特異的プライマーを用いたPCR法にて遺伝子増幅を行った。これらPCR増幅cDNAを、マイクロアレイスポッターにてガラススライド上に高密度固定し、ヒト歯根膜組織由来の約1500個の遺伝子が固定化されたヒト歯根膜DNAチップ(PerioGen Chip)を作製した。2)in vitro根尖性歯周炎モデルでの遺伝子発現解析炎症性サイトカインであるIL-1β、また歯周組織の修復・再生に関与しているFGF-2で培養ヒト歯根膜細胞の刺激実験を行い、in vitroで根尖性歯周炎の炎症期および創傷治癒期を再現した場合の遺伝子発現を解析した。FCS不含α-MEM培地にて24時間培養後、IL-1β(100ng/ml)あるいはFGF-2(100ng/ml)で刺激を行い、刺激12時間、24時間、48時間でそれぞれRNAを抽出した。蛍光色素にてサンプルを標識し、PerioGen Chipにて遺伝子発現解析を行った。その結果、IL-1βおよびFGF-2ともに、刺激24時間において著明な発現上昇を示す遺伝子群が検出された。次に、ヒト歯根膜DNAチップの根尖性歯周炎病態診断へ応用に向けたin vivoでの遺伝子発現解析を試みた。歯周外科手術時に採取した歯肉組織と培養歯肉線維芽細胞とにおける遺伝子発現をPerioGen Chipを用いて解析した。その結果、患者からの歯周組織で高い発現を示す遺伝子としてイムノグロブリン遺伝子やケモカイン遺伝子等の免疫担当細胞に特徴的な遺伝子が検出され、炎症組織での遺伝子発現解析の可能性が示された。

1）制备人类牙周膜片的人类牙周基因克隆大约1,500个基因克隆，该基因克隆来自3'-End cDNA的人牙周膜组织，已通过PCR使用PUC119库矢量特异性引物通过PCR进行了分离和鉴定和存储的人类牙周韧带组织。这些PCR放大的cDNA通过高密度使用微阵列的发现器在载玻片上固定，以制备人牙周韧带DNA芯片（尿果芯片），其中大约1,500个基因源自人牙周韧带组织。 2）在体外根尖牙周炎模型中，我们对培养的人牙周炎进行了刺激实验，使用IL-1β，一种炎症细胞因子和FGF-2进行了培养的人牙周炎细胞，与牙周炎的修复和再生有关，并在重现炎症和伤口治愈的周期时涉及牙周炎的修复和再生。在没有FCS 24小时的α-MEM培养基中孵育后，用IL-1β（100 ng/ml）或FGF-2（100 ng/ml）进行刺激，并在12、24和48小时的刺激下提取RNA。用荧光染料标记样品，并使用尿中芯片进行基因表达分析。结果，在24小时的刺激下检测到IL-1β和FGF-2表达显着增加的基因组。接下来，我们试图分析体内基因表达，以便将其用于诊断人类牙周韧带DNA芯片的牙周牙周炎病理学诊断。使用Pereogen芯片分析了牙周手术期间收集的牙龈组织中的基因表达和培养的牙龈成纤维细胞。结果，被检测到免疫细胞（例如免疫球蛋白基因和趋化因子基因）的基因作为基因，这些基因在患者的牙周组织中高度表达，表明炎症组织中基因表达分析的可能性。