赤痢菌のタイプIII分泌装置から分泌される核移行蛋白質,IpaH,に関する研究

志贺菌Ⅲ型分泌器分泌的核定位蛋白IpaH的研究

基本信息

批准号：
15659103
负责人：
奥田潤
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Hiroshima University (2004)The University of Tokyo (2003)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

ipaH9.8欠損変異株の病原性を、マウス肺炎惹起能を利用して野生株と比較するとipaH9.8欠損変異株では野生株に比べて炎症が著しく激化していた。そこでyeast two-hybrid法を利用して、IpaH9.8の標的宿主因子をスクリーニングした結果、splicing factor, U2AF35と結合することがわかった。U2AF35はマウスのIgM pre-mRNAのalternative splicing反応に必須であることが既に知られており、IpaH9.8のIgM遺伝子splicingへの影響を調べると、その反応はIpaH9.8の濃度依存的に阻害された。これらの知見から、赤痢菌から分泌された.IpaH9.8は宿主細胞の核内でU2AF35と結合し、U2AF35の機能を何らかの機序で抑制し、スプライシング異常を引き起こす結果、炎症反応に関わる因子の発現を抑制し、抗炎症作用を引き起こしていることが示唆された。そこで、RNAiの手法を用いてU2AF35発現をノックダウンしたHeLa細胞からRNAを抽出し、マイクロアレイ解析を行ったところ、非常に多くの遺伝子の発現が抑制されていたが、発現が抑制されていた遺伝子の中から、特に炎症に関わる遺伝子群を抽出したところ、炎症部位への好中球の遊走に重要な役割を果たすことが知られているケモカインである、IL-8やRANTES、さらにIL-1βやGM-CSFなどのサイトカインの発現が有意に抑制されていた。さらに、変異株と野生株で感染実験を行ったHeLa細胞およびマウスからRNAおよび肺ホモジネートをそれぞれ抽出し、IL-8,RANTES, IL-1β,GM-CSFの発現量をRT-PCRおよびELISAで調べたところ、変異株と比べて、野生株感染細胞およびマウスにおいてIL-8,RANTES, IL-1β,GM-CSFの有意な発現抑制が観察された。最後に、変異株感染マウスの肺における好中球の遊走量と定着菌数を調べたところ、野生株感染マウスに比べて、有意な好中球の遊走と菌数の減少がみられた。以上の結果から、赤痢菌が分泌するIpaH9.8は、タイプIII分泌装置によって宿主細胞内に打ち込まれた後、核内に移動し、宿主細胞のスプライシング反応を阻害し、免疫応答、特に好中球の遊走、に関わるケモカインやサイトカインの発現を抑制することで抗炎症作用を引き起こし、赤痢菌が宿主の免疫反応から逃れ、上皮細胞内で増殖し易くなるようにしていることが考えられる。

利用 ipaH9.8 缺陷突变株在小鼠中诱导肺炎的能力，将其致病性与野生型菌株进行比较。 ipaH9.8 缺陷突变株中的炎症明显比野生型更严重。拉紧。因此，我们利用酵母二杂交法筛选了IpaH9.8的靶宿主因子，发现其与剪接因子U2AF35结合。已知U2AF35对于小鼠中IgM前体mRNA的选择性剪接反应至关重要，并且在检查IpaH9.8对IgM基因剪接的影响时，该反应被IpaH9.8以浓度依赖性方式抑制。完成了。基于这些发现，志贺氏菌分泌的IpaH9.8与宿主细胞核中的U2AF35结合，通过某种机制抑制U2AF35的功能，并引起剪接异常，导致炎症反应相关因子的释放。它抑制表达并产生抗炎作用。因此，当我们使用RNAi从U2AF35表达被敲低的HeLa细胞中提取RNA并进行微阵列分析时，我们发现大量基因的表达被从内部抑制，尤其是火焰。当我们提取一组与疾病相关的基因时，我们发现了已知在中性粒细胞向炎症部位迁移中发挥重要作用的趋化因子，例如IL-8和RANTES，以及IL-1β和GM -CSF，细胞因子的表达被显着抑制。此外，分别从感染突变株和野生株的HeLa细胞和小鼠中提取RNA和肺匀浆，并通过RT-PCR测量IL-8、RANTES、IL-1β和GM-CSF的表达水平。在研究中，与突变株相比，在感染野生型株的细胞和小鼠中观察到 IL-8、RANTES、IL-1β 和 GM-CSF 的表达显着抑制。最后，当我们检查感染突变株的小鼠肺部中性粒细胞迁移量和定植细菌数量时，我们发现与感染野生株的小鼠相比，中性粒细胞迁移量和细菌数量显着减少。由以上结果可知，志贺氏菌分泌的IpaH9.8被III型分泌器驱动进入宿主细胞，进入细胞核，抑制宿主细胞的剪接反应，刺激免疫反应，特别是中性粒细胞。通过抑制参与细胞迁移的趋化因子和细胞因子的表达，它会产生抗炎作用，使志贺氏菌逃避宿主的免疫反应并在上皮细胞内增殖。