マウス遺伝子改変の高効率化:ターゲティングベクターの正確かつ迅速な構築法

高效小鼠基因修饰：精准快速的靶向载体构建方法

基本信息

批准号：
15657041
负责人：
和田洋
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

遺伝子改変マウスの作出は,複雑なin vitroでの遺伝子操作,ES細胞の培養,そして胚操作による個体の作出など,多数のステップからなる長期の綿密な実験を必要とする.本研究では大腸菌内相同組換え法を導入することにより,BACクローン上で迅速に遺伝子改変を進める遺伝子構築技術を確立する.このため,セレクションマーカとしてジフテリア毒素Aフラグメントを発現するベクターを改変し,Srf I, Pme Iなどのrare restriction siteを組込み、ES細胞に導入する際に直鎖化するのに便利なプラスミド,pBSDT-AIIを作成した.次に,ES細胞内駆動用PGK promoterと大腸菌内用EM7 promoterのキメラプロモータを使用し,さらにはES細胞内でNeoを選択的に除去できるようにするため,flp recombinaseの認識サイトとlox Pを両端にもつ遺伝子カセットをもつプラスミド,pGPS21loxFRTNeoを作成した.このカセットを実際にES細胞内に形成導入した結果,ES細胞にG418耐性を付与することが示された.さらに第三のlox Pを挿入するため,pMODloxZeoDAmp-3を構築した.このplasmidはTn5のtranspositionに必須な領域に挟まれた形でloxP-Zeo-loxPカセットを有しており,試験管内での反応により,カセットを任意のDNAに挿入することができる.これらの遺伝子モジュールを用いてmVam2, V-ATPase a3について遺伝子破壊を進め、キメラマウスの作出と遺伝子破壊マウスの作成に成功した.本手法の導入によって多細胞生物の遺伝子変換の最初のステップをきわめて効率化・迅速化することができた.

遗传修饰小鼠需要长期，深入的实验，包括许多步骤，包括复杂的体外遗传操纵，ES细胞培养以及通过胚胎操纵来创建个体。在这项研究中，我们将建立一种基因构建技术，该技术通过引入用于大肠杆菌的同源重组方法来快速改进BAC克隆的遗传修饰。为此，我们修改了表达白喉毒素片段作为选择标记的矢量，并创建了质粒PBSDT-AII，当引入ES细胞时，该质粒的线性化方便。接下来，我们将PGK启动子的嵌合启动子用于细胞内驱动器和EM7启动子进行大肠杆菌，并可以选择性地去除ES细胞中的NEO。我们创建了PGPS21LoxfrtNeo，这是一种带有重组酶识别位点的质粒和两端具有LOX P的基因盒。该盒实际上被形成并引入ES细胞，并显示出对ES细胞的G418抗性。此外，构建了pmodoxzeodamp-3以插入第三个LOXP。该质粒具有夹在TN5换位所必需的区域之间的LOXP-ZEO-LOXP盒，并且可以通过反应在试管中将盒式盒插入任何DNA中。这些基因模块用于使用MVAM2和V-ATPase。我们已经能够促进A3的基因破坏，并成功地创建了嵌合小鼠并创建了基因破坏小鼠。通过引入这种方法，我们能够显着改善和加速多细胞生物基因转化的第一步。