マウス遺伝子改変の高効率化:ターゲティングベクターの正確かつ迅速な構築法

高效小鼠基因修饰：精准快速的靶向载体构建方法

基本信息

批准号：
15657041
负责人：
和田洋
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

遺伝子改変マウスの作出は,複雑なin vitroでの遺伝子操作,ES細胞の培養,そして胚操作による個体の作出など,多数のステップからなる長期の綿密な実験を必要とする.本研究では大腸菌内相同組換え法を導入することにより,BACクローン上で迅速に遺伝子改変を進める遺伝子構築技術を確立する.このため,セレクションマーカとしてジフテリア毒素Aフラグメントを発現するベクターを改変し,Srf I, Pme Iなどのrare restriction siteを組込み、ES細胞に導入する際に直鎖化するのに便利なプラスミド,pBSDT-AIIを作成した.次に,ES細胞内駆動用PGK promoterと大腸菌内用EM7 promoterのキメラプロモータを使用し,さらにはES細胞内でNeoを選択的に除去できるようにするため,flp recombinaseの認識サイトとlox Pを両端にもつ遺伝子カセットをもつプラスミド,pGPS21loxFRTNeoを作成した.このカセットを実際にES細胞内に形成導入した結果,ES細胞にG418耐性を付与することが示された.さらに第三のlox Pを挿入するため,pMODloxZeoDAmp-3を構築した.このplasmidはTn5のtranspositionに必須な領域に挟まれた形でloxP-Zeo-loxPカセットを有しており,試験管内での反応により,カセットを任意のDNAに挿入することができる.これらの遺伝子モジュールを用いてmVam2, V-ATPase a3について遺伝子破壊を進め、キメラマウスの作出と遺伝子破壊マウスの作成に成功した.本手法の導入によって多細胞生物の遺伝子変換の最初のステップをきわめて効率化・迅速化することができた.

转基因小鼠的生产需要长期细致的实验，包括复杂的体外基因操作、ES细胞的培养、通过胚胎操作产生个体，通过引入同源重组方法，建立基因。允许对BAC克隆进行快速遗传修饰的构建技术。为此，我们将修饰表达白喉毒素A片段的载体作为选择标记，并使用Srf I、Pme我们创建了pBSDT-AII，这是一种包含罕见限制性位点（如I）的质粒，当引入ES细胞时便于线性化，我们还创建了flp重组酶和lox的识别位点，以选择性去除Neo。 ES细胞。我们创建了一个质粒 pGPS21loxFRTNeo，它具有两端带有 P 的基因盒。实际形成该基因盒并将其引入 ES 细胞的结果表明，它赋予 ES 细胞 G418 抗性。此外，第三个 lox为了插入 P，我们构建了 pMODloxZeoDAmp-3，该质粒具有夹在 Tn5 转座必需区域之间的 loxP-Zeo-loxP 盒，并且该盒可以通过体外反应插入到任何 DNA 中。模块 mVam2、V-ATPase我们继续对a3进行基因破坏，并成功创建了嵌合小鼠和基因破坏小鼠。通过引入这种方法，我们能够大大简化和加速多细胞生物中基因转换的第一步。