ミトコンドリアにおける異性化アミノ酸含有蛋白質の代謝機構の解明

阐明线粒体中异构化氨基酸蛋白的代谢机制

基本信息

批准号：
15657030
负责人：
木野内忠稔
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Kyoto University (2004-2005)Jichi Medical University (2003)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

ミトコンドリアにおけるD-Asp含有蛋白質の動態を調査するため、D-Asp含有ペプチドを抗原として特異的な抗体(以下、抗D-Asp抗体)を作成し、二次元電気泳動とウエスタンブロッティングにより、その網羅的検出を試みた。まず、通常培養のHep G2(ヒト肝癌由来株細胞)からミトコンドリアを分離し、そのホモジェネートに対して検出を行った。その結果、予想外に陽性スポットが多く検出された(〜40個)。当初、酸化ストレスを与えない限り、蛋白質中のAsp残基のラセミ化は起きにくいと考えていたので、この結果は、作成した抗D-Asp抗体の特異性に疑問をもたせるものであった。従って、別途精製したD-Asp含有蛋白質分解酵素:D-aspartyl endopeptidase(DAEP)をその抽出液に加え、スポットの減少を観察した。なぜなら、DAEPはD-Asp含有蛋白質を特異的に分解するので、DAEPを加えたミトコンドリア抽出液では、D-Asp含有蛋白質が分解され、抗D-Asp抗体では検出できなくなるはずだからである。その結果、およそ半分のスポットが減少した。従って、得られた抗D-Asp抗体陽性スポットの全てがD-Asp含有蛋白質ではないことが判明した。しかしながら、多くの陽性スポットが、DAEPの添加によって消失する、即ち、D-Asp含有蛋白質であることが示唆されたことも確かである。D-Asp含有蛋白質の網羅的な検索方法は、効率や感度の点から本法をおいて他に無い。従って、上述のように抗D-Asp抗体とDAEPと組み合わせて検出すれば、判断を誤ることなくD-Asp含有蛋白質の同定も可能であろう。今後は本法の検出精度をより高め、ストレスの有無によるD-Asp含有蛋白質の生成量の変化について調査したいと考えている。

为了研究线粒体中含D-ASP的蛋白的动力学，使用含D-ASP的肽作为抗原制备了一种特异性抗体（以下称为抗D-Asp抗体），并通过二维电泳和蛋白质作用尝试了全面检测。首先，从正常培养的HEP G2（源自人肝癌的细胞）中分离线粒体，并检测到匀浆。结果，出乎意料地检测到许多正斑（〜40）。最初，我们认为蛋白质中ASP残基的种族化不太可能发生，除非施加氧化应激，否则该结果对产生的抗D-ASP抗体的特异性产生了怀疑。因此，将单独纯化的含D-App的蛋白酶：D-冬酰胺内肽酶（DAEP）添加到提取物中，并观察到斑点还原。这是因为DAEP特异性降解了含D-ASP的蛋白，因此在带有DAEP的线粒体提取物中，添加了含D-App的蛋白，应将它们降解，并且无法通过抗D-ASP抗体检测到。结果，大约一半的斑点减少了。因此，发现并非所有产生的抗D-Asp抗体阳性斑点都是含有D-Asp的蛋白质。但是，还可以肯定的是，由于添加DAEP，即，含D-App的蛋白质，已经建议许多阳性斑点丢失。除了在效率和敏感性方面，没有其他用于含D-ASP的蛋白质的全面搜索方法。因此，如果如上所述将检测与抗D-ASP抗体和DAEP结合进行，则可以鉴定含D-APP的蛋白质而无需错误的判断。将来，我们希望进一步提高该方法的检测准确性，并研究由于存在或不存在压力而产生的含D-ASP的蛋白质的变化。

项目成果

期刊论文数量（11）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

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关于含D-天冬氨酸蛋白质的产生机制及其降解酶的抗衰老机制

DOI：
发表时间：
2005
期刊：
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影响因子：
0
作者：
木野内忠稔;藤井紀子;香川靖雄;浜本敏郎
通讯作者：
浜本敏郎

哺乳類におけるD-アスパラギン酸含有タンパク質に対する特異的な分解酵素について

关于哺乳动物中含有 D-天冬氨酸的蛋白质的特异性降解酶

DOI：
发表时间：
2005
期刊：
原子炉実験所だより 67(3)
影响因子：
0
作者：
木野内忠稔;藤井紀子;香川靖雄;浜本敏郎;木野内忠稔
通讯作者：
木野内忠稔

Tadatoshi Kinouchi: "Mammalian D-asparfyl endopeptidase : a scavenger for noxious racemized proteins in aging"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 314. 730-736 (2004)

Tadatoshi Kinouchi：“哺乳动物 D-天门冬酰内肽酶：衰老过程中有害外消旋蛋白的清除剂”Biochem.Biophys.Res.Commun.. 314. 730-736 (2004)

DOI：
发表时间：
期刊：
影响因子：
0
作者：
通讯作者：

哺乳類におけるD-アミノ酸の動態とその重要性

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DOI：
发表时间：
2005
期刊：
蛋白質核酸酵素 50
影响因子：
0
作者：
Kaori Kurashima-Ito;Kaori Kurashima-Ito;木野内忠稔
通讯作者：
木野内忠稔

老化タンパク質中のD-アスパラギン酸の生成機構とその修復

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DOI：
发表时间：
2005
期刊：
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0
作者：
藤井紀子
通讯作者：
藤井紀子

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森崎　珠実１），野田　諭２），湯山　友美3），中村　桂子3），山下　真理子3），吉田　麻弥3），野口　麻理3），中島　麻美子3），柏木　伸一郎２），福本　真也1)，高島　勉２），小野田　尚佳２），平田　一人1)，平川　弘聖２），大平　雅一２）