唾液中亜鉛結合タンパク質による味覚障害の診断法の開発

开发利用唾液锌结合蛋白诊断味觉障碍的方法

• 批准号: 13877331
• 负责人: 清野 和夫
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Ohu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13877331/
• 关键词: 亜鉛結合タンパク質; 炭酸脱水酵素VI型; 味覚障害; Gustin; ELSA法; ポリクローナル抗体; 耳下腺唾液; 電気泳動; ELISA法; ウエスタンブロット

【背景および目的】味覚異常の患者のうち約60%は亜鉛治療を必要とするといわれている。亜鉛欠乏に起因した味覚異常では、耳下腺唾液中の37kDaの亜鉛結合タンパク密(Gustin)濃度が低下しており、このタンパク質はヒト炭酸脱水酵素VI型と相同性があることが報告されている。そこで本研究では、味覚障害者の唾液を採取し、ヒト炭酸脱水酵素VI型アミノ酸合成ペプチドに対する抗体を用いた抗児抗体反応すなわちELISA法により37kDa亜鉛結合タンパク質の検出を行い、味覚異常診断のパラメータとすることを目的とした。【方法と結果】披験者(味覚正常者、障害者)から安静時に全唾液および耳下腺唾液を採取し、各々の味覚閾値用背景を確認するために四基本味に対する検査を行った。一方既知のヒト炭酸脱水酵素VI型アミノ酸配列から選択したアミノ酸配列より合成ペプチドを作成し、ウサギ2羽に免疫して抗血清を得た。精製の後、スタンダードとして用いた。ELISA法としてマルチプレートにCoating Bufferにて希釈した合成ペプチドおよび各種唾液をコーティングした。続いて作成したポリクローナル抗体を一次抗体(2500培希釈)として加え、二次抗体にはヤギ抗ウサギIgG (500倍希釈)を用いた。さらにアビジンビオチン法にて反応させ、発色させた。その結果、スタンダードカーブは12.5〜400ng/mlの範囲でほぼ直線性が得られた。CAVIの濃度は、全唾液における味覚正常者の平均値は333.5ng/ml、味覚異常者は53.3ng/ml、耳下腺における正常者の平均値は1327.0ng/ml、異常者は203.1ng/mlであった。従って全唾液に対して耳下腺唾液中はおよそ4倍、異常者に対して正常者はおよそ6倍であった。【まとめ】作成した抗体を用いて、非侵襲的かつ簡便な検査法として味覚異常の診断の一助となり意義深い他のと考えられる。

[背景和目的] 据说大约 60% 的味觉障碍患者需要锌治疗。据报道，缺锌引起的味觉障碍中，腮腺唾液中37kDa锌结合蛋白Gustin的浓度降低，这种蛋白与人VI型碳酸酐酶有同源性。因此，在本研究中，我们收集了味觉障碍患者的唾液，并使用抗人碳酸酐酶VI型氨基酸合成肽的抗体，通过抗婴儿抗体反应，即ELISA方法检测了37kDa的锌结合蛋白。是为了[方法与结果] 采集受试者（正常味觉受试者和残疾受试者）休息时的全唾液和腮腺唾液，对四种基本味觉进行测试，以确定各味觉阈值的背景。另一方面，根据选自已知的人碳酸酐酶VI型氨基酸序列的氨基酸序列制备合成肽，并用其免疫两只兔子以获得抗血清。纯化后作为标准品。对于 ELISA 方法，用用包被缓冲液和各种唾液稀释的合成肽包被多层板。随后，添加制备的多克隆抗体作为一抗（2500倍稀释），并使用山羊抗兔IgG（500倍稀释）作为二抗。另外，通过抗生物素蛋白-生物素法反应而显色。结果，标准曲线在12.5至400ng/ml范围内几乎呈线性。味觉正常人全唾液中CAVI的平均浓度为333.5ng/ml，味觉障碍者为53.3ng/ml，腮腺中正常人的平均值为1327.0ng/ml，味觉障碍者的平均浓度为1327.0ng/ml。味觉异常者为203.1ng/ml。因此，腮腺唾液中的含量约为全部唾液的4倍，正常个体中的含量约为异常个体的6倍。 [摘要] 利用产生的抗体，这种非侵入性且简单的检测方法被认为具有重要意义，因为它可以帮助诊断味觉异常。