p53標的遺伝子群の転写活性化を指標にした消化器癌の抗癌剤感受性の検索

以p53靶基因转录激活为指标寻找胃肠癌抗癌药物敏感性

基本信息

批准号：
13877030
负责人：
藤盛孝博
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Dokkyo Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

種々の消化器癌に存在するp53遺伝子の機能的な異常を検索するシステムの開発を試みた。まず,種々の消化器癌培養細胞(HSG,TYS,BHY,HNt,AZA1,AZA3)よりp53 cDNAの全翻訳領域をPCRで増幅し,蛍光蛋白質GFP遺伝子を有する発現ベクターに組み込んだ。全塩基配列を決定すると同時に,細胞内局在,標的遺伝子(p21waf1,MDM2,BAX,p53AIP1,PUMA)に対する転写活性化能を検索した。ヒト骨肉腫細胞であるSaos-2細胞に癌細胞由来のp53遺伝子を発現させたところ,AZA1,AZA3由来の野生型p53とHSG由来の変異p53(Asn30Ser),TYS由来の変異p53(ASP30His)は明らかに核に局在した。びまん性に細胞質に拡散が認められた。また,HSG由来p53は野生型とほぼ同様の転写活性化能を有し,HNt由来p53(Glu17Lys,His193Leu), BHY由来p53(delta121)は全く転写活性化能を示さなかった。TYS由来p53はMDM2,BAX,p53AIP1,PUMAに対しては転写活性化能を示さないが,p21waf1に対してはむしろ野生型よりも強い転写活性化能を有していた。このようなp53変異はDNA障害に際し,細胞周期は止めるが,アポトーシスは誘導しないという,癌細胞の生存あるいは悪性形質獲得に極めて重要な変異であると考えられる。同様の方法で進行大腸癌組織において同様の検索を行ったところ,免疫染色で全くp53蛋白質が染色されないが,PCR-SSCPではExon 5とExon 8にmobility shiftが見られる症例で,従来の方法では検索しないExon 4に大きな約100bpの塩基欠失が見られ,その結果フレームシフトによりトランケート型のp53蛋白を産生するような変異を検出した。以上の結果から,我々が構築したp53機能異常検索システムは多様なp53の機能異常を検索することが可能であると考える。

我们试图开发一个系统来寻找各种胃肠道癌症中 p53 基因的功能异常。首先，通过PCR从各种胃肠癌培养细胞（HSG、TYS、BHY、HNt、AZA1、AZA3）中扩增p53 cDNA的整个翻译区域，并将其插入含有荧光蛋白GFP基因的表达载体中。在确定整个碱基序列的同时，我们寻找其对靶基因（p21waf1、MDM2、BAX、p53AIP1、PUMA）的细胞内定位和转录激活能力。当源自癌细胞的p53基因在人骨肉瘤细胞Saos-2细胞中表达时，衍生自AZA1和AZA3的野生型p53、源自HSG的突变型p53(Asn30Ser)和源自TYS的突变型p53(ASP30His)它明显定位于细胞核。在细胞质中观察到弥散扩散。此外，HSG来源的p53具有与野生型几乎相同的转录激活能力，而HNt来源的p53（Glu17Lys、His193Leu）和BHY来源的p53（delta121）则没有表现出转录激活能力。 TYS来源的p53对MDM2、BAX、p53AIP1和PUMA没有转录激活能力，但对p21waf1具有比野生型更强的转录激活能力。当DNA损伤发生时，这种p53突变会停止细胞周期，但不会诱导细胞凋亡，被认为是对癌细胞生存或获得恶性特征极其重要的突变。当我们使用相同的方法对晚期结直肠癌组织进行类似的搜索时，我们发现在某些情况下，p53蛋白通过免疫染色根本没有被染色，但通过PCR-SSCP在外显子5和外显子8中观察到迁移率变化；在外显子 4 中发现了大约 100 bp 的大碱基缺失，但未对其进行搜索，并且检测到由于移码而导致产生截短 p53 蛋白的突变。从以上结果来看，我们认为我们构建的p53功能异常搜索系统能够搜索各种p53功能异常。