p53標的遺伝子群の転写活性化を指標にした消化器癌の抗癌剤感受性の検索

以p53靶基因转录激活为指标寻找胃肠癌抗癌药物敏感性

基本信息

批准号：
13877030
负责人：
藤盛孝博
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Dokkyo Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

種々の消化器癌に存在するp53遺伝子の機能的な異常を検索するシステムの開発を試みた。まず,種々の消化器癌培養細胞(HSG,TYS,BHY,HNt,AZA1,AZA3)よりp53 cDNAの全翻訳領域をPCRで増幅し,蛍光蛋白質GFP遺伝子を有する発現ベクターに組み込んだ。全塩基配列を決定すると同時に,細胞内局在,標的遺伝子(p21waf1,MDM2,BAX,p53AIP1,PUMA)に対する転写活性化能を検索した。ヒト骨肉腫細胞であるSaos-2細胞に癌細胞由来のp53遺伝子を発現させたところ,AZA1,AZA3由来の野生型p53とHSG由来の変異p53(Asn30Ser),TYS由来の変異p53(ASP30His)は明らかに核に局在した。びまん性に細胞質に拡散が認められた。また,HSG由来p53は野生型とほぼ同様の転写活性化能を有し,HNt由来p53(Glu17Lys,His193Leu), BHY由来p53(delta121)は全く転写活性化能を示さなかった。TYS由来p53はMDM2,BAX,p53AIP1,PUMAに対しては転写活性化能を示さないが,p21waf1に対してはむしろ野生型よりも強い転写活性化能を有していた。このようなp53変異はDNA障害に際し,細胞周期は止めるが,アポトーシスは誘導しないという,癌細胞の生存あるいは悪性形質獲得に極めて重要な変異であると考えられる。同様の方法で進行大腸癌組織において同様の検索を行ったところ,免疫染色で全くp53蛋白質が染色されないが,PCR-SSCPではExon 5とExon 8にmobility shiftが見られる症例で,従来の方法では検索しないExon 4に大きな約100bpの塩基欠失が見られ,その結果フレームシフトによりトランケート型のp53蛋白を産生するような変異を検出した。以上の結果から,我々が構築したp53機能異常検索システムは多様なp53の機能異常を検索することが可能であると考える。

我们试图开发一个系统来搜索各种消化癌中存在的p53基因中的功能异常。首先，所有p53 cDNA的翻译区域均通过PCR从各种培养的消化癌细胞（HSG，TYS，BHY，HNT，AZA1，AZA3）放大，并掺入携带荧光蛋白GFP基因的表达载体中。确定了整个碱基序列，同时搜索了靶基因的亚细胞定位和转录激活能力（P21WAF1，MDM2，BAX，P53AIP1，PUMA）。当癌症衍生的p53基因在人骨肉瘤SAOS-2细胞中表达时，衍生自AZA1和AZA3的野生型p53，源自HSG（ASN30SER）的突变p53，而突变体P53则衍生自Tys（ASP30HIS）衍生自tys（ASP30HIS）。弥漫性扩散在细胞质中。此外，HSG衍生的p53的转录激活能力与野生型的转录激活能力几乎相同，而HNT衍生的p53（GLU17LYS，HIS193LEU）和BHY衍生的p53（Delta121）均显示没有转录激活能力。尽管TYS衍生的p53没有显示MDM2，BAX，P53AIP1和PUMA的转录激活能力，但P21WAF1的转录激活能力比野生型具有更强的转录激活能力。这种p53突变被认为对于癌细胞的存活或恶性特征的获取非常重要，因为它们停止了细胞周期，但在DNA损伤的情况下不会诱导凋亡。 A similar search was performed in advanced colon cancer tissues using the same method, and in cases where the p53 protein was not stained at all by immunostaining, PCR-SSCP showed mobility shifts in Exon 5 and Exon 8, and large base deletion of approximately 100 bp was found in Exon 4, which was not searched by conventional methods, and as a result, a mutation that produced a truncated p53 protein was detected by frameshift.基于上述结果，我们认为我们构建的p53功能异常搜索系统可以在p53中搜索各种功能异常。