分子シャペロンの脂質二分子膜への階層的固定化による蛋白質修復システムの構築

脂质双层膜上分子伴侣分级固定化构建蛋白质修复系统

基本信息

批准号：
12780439
负责人：
田中直毅
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Kyoto Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞内における蛋白質の生合成においてDnaJ, DnaK, GroELなどの分子シャペロンは協同的に作用して蛋白質の立体構造形成の補助、立体構造の修復を行う。これを模倣すれば凝集した蛋白質を立体構造を修復し、機能を再生することができる。この目的のため、脂質二重膜を表面にDnaJ, DnaK, GroELを固定化したデバイスを構築したが、タンパク質修復機能を充分得ることは出来なかった。これは分子シャペロンが協同的に作用しなかった為であり、より効率的な機構を構築するためにはシャペロン単独で機能するデバイスにする必要がある。そこで本研究ではDnaK単独での機能発現を目指す研究を行った。DnaKはN末端のATPase部位とC末端の基質結合部位からなり、前者の活性により後者が構造変化して基質を脱着する。DnaKのシャペロン活性発現にはATP加水分解で得たエネルギーを用いた基質結合部位の運動が不可欠とされてきた。しかし同様の機構で働く分子シャペロンGroELでは基質結合部位断片単独でも活性を有することが知られている。そこでDnaKからATPase部位を除いた基質結合部位断片DnaK384-638のルシフェラーゼとβGalactosidaseの構造形成に対する効果を調べたDnaK基質結合部位の遺伝子を大腸菌からクローニングし蛋白質発現用ベクターに組み込み大量発現してフラグメントを作成した。基質結合部位断片の存在下でルシフェラーゼとβGalactosidaseのリフォールディングの収率が改善した。また基質結合部位断片はこれらの蛋白質の凝集を抑制することを散乱測定によって確認するとともに、蛍光標識したDnaK384-638を用いて断片が構造形成中間体と相互作用することも確認した。DnaKのシャペロン活性発現には基質認識部位のclose型とopen型の間の連続的な構造転移が必要であるが、ATPase活性のない基質結合部位断片単独でも熱揺らぎによってこの転移が生じている。そのため断片単独でも、低速度の構造形成に対してはシャペロン活性を示すと考えられる。これにより今後DnaKの基質結合部位フラグメントを脂質二重膜を表面に導入することで本研究の目的のデバイスを構築できると考えられる。

在细胞内蛋白质生物合成中，DnaJ、DnaK、GroEL等分子伴侣协同作用，协助蛋白质三维结构的形成和三维结构的修复。通过模仿这一点，可以恢复聚集蛋白质的三维结构并恢复其功能。为此，我们构建了一种将DnaJ、DnaK和GroEL固定在脂质双层膜表面的装置，但我们无法获得足够的蛋白质修复功能。这是因为分子伴侣不能协同工作，为了构建更有效的机制，有必要创建一种仅与伴侣一起发挥作用的装置。因此，在本研究中，我们的目的是单独表达DnaK的功能。 DnaK 由 N 端的 ATP 酶位点和 C 端的底物结合位点组成，前者的活性导致后者发生结构变化并解吸底物。据信，利用 ATP 水解获得的能量移动底物结合位点对于 DnaK 伴侣活性的表达至关重要。然而，已知分子伴侣 GroEL 的工作原理与此类似，即使仅使用底物结合位点片段也具有活性。因此，我们研究了从DnaK中去除ATP酶位点得到的底物结合位点片段DnaK384-638对荧光素酶和β半乳糖苷酶结构形成的影响。DnaK底物结合位点的基因是从埃希氏菌中克隆的大肠杆菌，插入蛋白质表达载体，并大量表达以产生片段。在底物结合位点片段存在的情况下，荧光素酶和β半乳糖苷酶的重折叠产量得到提高。此外，我们通过散射测量证实底物结合位点片段抑制了这些蛋白质的聚集，并且还使用荧光标记的 DnaK384-638 证实了这些片段与结构形成中间体相互作用。 DnaK 伴侣活性的表达需要底物识别位点的闭合形式和开放形式之间的连续结构转变，并且即使对于由于热波动而没有 ATPase 活性的单个底物结合位点片段也会发生这种转变。因此，即使是单独的片段也被认为表现出缓慢结构形成的伴侣活性。这表明，通过将DnaK的底物结合位点片段引入到脂质双层膜的表面上，将有可能构建本研究的目标装置。