ウェルシュ菌のε毒素の活性化機構ならびにプロペプチド断片の機能解析

产气荚膜梭菌ε毒素激活机制及前肽片段功能分析

• 批准号: 12770138
• 负责人: 宮田 茂
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kagawa Medical School
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12770138/
• 关键词: Clostridium perfringens; ε毒素; 毒素活性化; プロペプチド; 7量体; シナプトソーム

ウェルシュ菌ε毒素は、トリプシンやキモトリプシン、本菌自体が産生するλ毒素(サーモリシン様プロテイナーゼ)によって、N-末端領域とC-末端領域が共にプロセシングされて活性化される。平成12年度に4種の変異毒素(PD,ΔN-PD,ΔC-PD及びΔNC-PD)を用いて、εプロトキシンのC-末端領域のプロセシングが細胞毒性・致死活性の発現に必須であること明らかにした。今年度はε毒素の標的の一つと考えられている神経細胞の細胞膜との反応性を調べた。^<125>IラベルしたΔC-PDとΔNC-PDを、ラット脳シナプトソーム膜と反応させたところ、それぞれ約200kDaと約180kDaのSDS耐性高分子量複合体を形成した。一方、細胞毒性・致死活性を示さないPDとΔN-PDは、高分子量複合体を形成しなかった。また、^<125>I-ΔC-PDと^<125>I-ΔNC-PDを種々の濃度で混合して高分子量複合体を形成させたところ、約200kDaと約180kDaの間にブロードなバンドが確認されたことより、高分子量複合体は数分子の毒素からなることが示唆されたが、解像度が低すぎて何分子の毒素により高分子量複合体が形成されているのか判明しなかった。そこで解像度を上げるために、1毒素分子あたり1分子の^<32>Pでラベルした変異毒素(^<32>P-ΔC-PDと^<32>P-ΔNC-PD)を調製し、それらを種々の濃度で混合しシナプトソーム膜と反応させ、DNA sequence用ゲル装置を用いた高解像度SDS-PAGEを行った。その結果、2つのホモマルチマーの間に6つの分離したバンドが検出された。これらのことから、C-末端領域がプロセシングされて活性化したε毒素はラットシナプトソーム膜内で7量体を形成することが明らかになった(Miyata et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:13778-13783)。

产气荚膜梭状芽胞杆菌ε毒素通过细菌本身产生的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和 lambda 毒素（嗜热菌蛋白酶）处理其 N 末端和 C 末端区域而被激活。 2000年，我们使用四种突变毒素（PD、ΔN-PD、ΔC-PD和ΔNC-PD）证明ε原毒素C末端区域的加工对于细胞毒性和致死活性的表达至关重要。据透露。今年，我们研究了神经细胞与细胞膜的反应性，神经细胞被认为是ε-毒素的目标之一。当125 I标记的ΔC-PD和ΔNC-PD与大鼠脑突触体膜反应时，它们分别形成约200kDa和180kDa的SDS抗性高分子量复合物。另一方面，PD和ΔN-PD不表现出细胞毒性或致死活性，没有形成高分子量复合物。此外，当将^ 125 I-ΔC-PD和^ 125 I-ΔNC-PD以不同浓度混合以形成高分子量复合物时，确认到约200kDa至约180kDa之间的宽带。 ，表明高分子量复合物是由几个毒素分子组成的，但分辨率太低，无法确定有多少分子毒素形成高分子量复合物。因此，为了提高分辨率，我们制备了突变毒素（^ 32 P-ΔC-PD和^ 32 P-ΔNC-PD），每个毒素分子用^ 32 P标记一个分子，并以不同浓度混合并与突触体膜反应，并使用凝胶装置进行高分辨率 SDS-PAGE 进行 DNA 测序。结果，在两个同源多聚体之间检测到六个独立的条带。这些结果表明，其C端区域被加工的活化的ε-毒素在大鼠突触体膜内形成七聚体(Miyata等人(2001)J.Biol.Chem.276：13778-13783)。

项目成果

Msigeru Miyata: "Cleavage of a C-terminal peptide is essential for heptamerization of Clostridium perfringens ε-toxin in the synaptosomal membrane"The Journal of Biological Chemistry. 276・17. 13778-13783 (2001)

Msigeru Miyata：“C 末端肽的切割对于突触体膜中产气荚膜梭菌 ε-毒素的七聚化至关重要”《生物化学杂志》276·17 (2001)。