STn抗原を認識するレセプター蛋白のクローニングと胃癌の進展に及ぼす機能の解析

STn抗原受体蛋白的克隆及其在胃癌进展中的作用分析

• 批准号: 12770104
• 负责人: 池原 譲
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Aichi Cancer Center Research Institute
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12770104/
• 关键词: シアル酸結合蛋白; STn抗原; シアル酸結合性蛋白; 発現クローニング; リン酸化ドメイン

1)ヒト胃癌組織および末梢血よりmRNAを精製し、Super Script Choice Systemで2本鎖cDNAを合成し、Uni-ZAP XR Vector/Gigapack Cloning Kitによって約1000,000個のindependent cloneを含むcDNAライブラリーを構築した。北海道大学工学部、西村紳一郎教授から供与頂いた、-[Ala-Thr(aGalNAc)Ala]n-に、ヒトST6GalNAcIのリコンビナント酵素とCMP-NeuAc[^<14>C]とでシアル化し、[^<14>C]ラベルのSTn抗原プローブの調製を行った。[^<14>C]ラベルSTn抗原プローブを用いて発現クローニングを行い、未同定のクローンを得て解析中である。2)近年、ヒトを中心に次々と明らかにされたシアル酸結合性蛋白(レクチン)であるSiglecのなかにも、Siglec 6のようにSTn抗原と結合性を示すものが含まれる。そこで、ESTデータベースの相同性検索により、siglecファミリーに含まれるシアル酸結合性蛋白を同定し、約2.5kbpのcDNAをクローニングした。単離した遺伝子から推定される蛋白はSiglec 6にもっとも高い相同性を示すが、その他のSiglecがもつC末側の膜貫通部位を欠くものであった。それゆえ、糖鎖がsiglecのN末の細胞外ドメインが結合することでリン酸化される細胞質内ドメインのImmunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif(ITIM)も欠くものであった。代表的な培養細胞株と組織での発現を検討し、一部の胃癌細胞株、および胃癌組織において発現を認めた。分泌シグナルをつけ、Protein Aとの融合蛋白として発現させ、COS細胞に発現しIgGセファローズビーズで回収し検討したところ、Fetuinとは結合したが、アシアロ化Fetuinとの結合性は示さなかった。

1) 从人胃癌组织和外周血中纯化mRNA，使用Super Script Choice System合成双链cDNA，并使用Uni-ZAP XR Vector/Gigapack Cloning Kit构建包含约1,000,000个独立克隆的cDNA文库。 -[Ala-Thr(aGalNAc)Ala]n-，由北海道大学工学院 Shinichiro Nishimura 教授惠赠，用人 ST6GalNAcI 重组酶和 CMP-NeuAc[^14C] 进行唾液酸化，并且[制备[ 14 C]-标记的STn抗原探针。使用[ 14 C]标记的STn抗原探针进行表达克隆，获得了未鉴定的克隆并且目前正在分析。 2) Siglecs是近年来陆续发现的、主要在人类中发现的唾液酸结合蛋白（凝集素），其中有一些，例如Siglec 6，显示出与STn抗原的结合。因此，通过EST数据库的同源性搜索，我们鉴定了siglec家族中包含的唾液酸结合蛋白，并克隆了约2.5kbp的cDNA。从分离基因推导的蛋白质与Siglec 6具有最高的同源性，但缺乏其他Siglec所具有的C端跨膜位点。因此，它也缺乏基于免疫受体酪氨酸的抑制基序（ITIM），这是一种胞浆内结构域，其糖链通过与 siglec 的 N 端胞外结构域结合而被磷酸化。我们检查了代表性培养细胞系和组织中的表达，发现在一些胃癌细胞系和胃癌组织中表达。当附加分泌信号时，该蛋白与 Protein A 形成融合蛋白，在 COS 细胞中表达，并使用 IgG Sepharose 珠进行回收。它与胎球蛋白结合，但未表现出与去唾液酸化胎球蛋白的结合。

项目成果

稲田健一: "Identification of Paneth cells in pylorie glands associated with gastric and intestinal mixed type intestinal metaplasia of the human stomach."Virchows Archiver. (in press). (2001)

Kenichi Inada：“鉴定与人胃胃和肠混合型肠化生相关的幽门腺中的潘氏细胞”（Virchows Archiver）（2001 年出版）。

Yuzuru Ikehara: "Polymorphisms of Two Fucosyltransferase Genes (Lewis and Secretor Genes) Involving Type I Lewis Antigens Are Associated with the Presence of Anti-Helicobacter Pylori IgG Antibody"Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.. 10(9). 971-977 (2001)

Yuzuru Ikehara：“涉及 I 型 Lewis 抗原的两个岩藻糖基转移酶基因（Lewis 和分泌基因）的多态性与抗幽门螺杆菌 IgG 抗体的存在相关”癌症流行病学生物标志物 Prev.. 10(9)。

Seiji Ito: "Real-time observation of micrometastasis formation in the living mouse liver using a green fluorescent protein gene-tagged rat tongue carcinoma"Int J Cancel. 93(2). 212-217 (2001)

Seiji Ito：“使用绿色荧光蛋白基因标记的大鼠舌癌实时观察活体小鼠肝脏中微转移的形成”Int J Cancel。

黒澤信幸: "Molecular Cloning and Genomic Analysis of Mouse GalNAc α2,6-Sialyltransferase (ST6GalNAc 1)."Journal of Biochem (Tokyo). May127(5). 845-854 (2000)

Nobuyuki Kurosawa：“小鼠 GalNAc α2,6-唾液酸转移酶 (ST6GalNAc 1) 的分子克隆和基因组分析”。《生物化学杂志》(东京) 845-854 (2000)。

Ken-Ichi Inada: "Identification of Paneth cells in pyloric glands associated with gastric and intestinal mixed-type intestinal metaplasia of the human stomach"Virchows Arch.. 439(1). 14-20 (2001)

Ken-Ichi Inada：“与人胃的胃和肠混合型肠化生相关的幽门腺中潘氏细胞的鉴定”Virchows Arch.. 439(1)。