食餌摂取に応答する組織蛋白質合成の翻訳伸長調節機構の解析

组织蛋白合成响应食物摄入的翻译延伸调节机制分析

基本信息

批准号：
12760098
负责人：
吉澤史昭
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Utsunomiya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

翻訳段階の重要な調節段階であるペプチド鎖伸長段階に注目し、ペプチド鎖伸長を調節する因子のうち伸長因子1(EF-1)と伸長因子2(EF-2)の活性測定法の確立を試みた。EF-1はα、β、β'、γ(またはα、β、γ)サブユニットより構成されており、GTPおよびaa-tRNA存在下に、EF-1α・GTP・aa-tRNA三重複合体を形成し、aa-tRNAをリボソームに結合させ、EF-1α・GDPがリボソームから遊離する。EF-1α・GDPからEF-1α・GTPを再生するββ'γのGDP/GTP交換活性が伸長活性に大きく影響することからββ'γのGDP/GTP交換活性を測定することが重要である。予め調製しておいたEF-1α・[^3H]GDPを基質として用いて、ラット肝臓のββ'γのGDP/GTP交換活性の測定を試みたが、生体内のββ'γ活性を評価できる測定方法の確立には至らなかった。ββ'γを組織から調製する際に用いる緩衝液および活性測定を行う際の温度の検討が今度の課題である。ペプチド鎖転移反応を触媒するEF-2は、その活性がリン酸化により調節されている。EF-2のリン酸化状態を調べるためには抗EF-2抗体が必要であるが、EF-2は動物種間での相同性が高く抗体作製が困難である。そこでEF-2の活性に関係するリン酸化部位(Thr56)付近のアミノ酸配列と同様なペプチド(ARAGETRFTDTRKD)を合成し、N末端にCysを添加しキャリアータンパク質(KLH)と結合させてこれを抗原としてウサギに免疫した。得られた抗血清から抗体をAffinity精製し、この抗体を用いてラットEF-2の検出を試みた。ラットの組織から調製したEF-2を等電点電気泳動法でリン酸化状態の違いにより分離し、その後作製した抗ペプチド抗体を用いてイムノブロットを行った結果、リン酸化EF-2と非リン酸化EF-2の両方が検出された。本研究で作製した抗ペプチド抗体はラットEF-2のリン酸化状態の測定に利用可能であり、EF-2のリン酸化状態を調べることでEF-2の活性を予想することが可能である。

专注于肽链支持阶段，这是翻译阶段的重要调整阶段，建立了扩展因子1（EF-1）的活动测量方法和扩展因子2（EF-2）我尝试了肽链。 EF-1由α，β，β'，γ（或α，β，γ）亚基组成，在GTP和AA-TRNA的存在下，EF-1α，GTP，AA-TRNA三元复合物核糖体的AA-tRNA和EF-1α / GDP从核糖体释放。重要的是要测量β'γ的GDP/GTP替代活性，因为从EF-1α/GDP中播放EF-1α/GTP的ββ'γ的GDP/GTP替代活性对延伸活性具有显着影响。我们试图使用事先制备的EF-1α和[^3H] GDP测量大鼠肝β'γ的大鼠肝β'γ的GDP/GTP交换活性，无法建立测量方法。这是检查从组织制备ββ'γ时使用的缓冲液温度和活性测量温度的下一个挑战。通过磷酸化来调节催化肽条过渡反应的EF-2。需要抗EF-2抗体检查EF-2的磷酸化状态，但是EF-2在动物物种之间是同源的，并且很难产生抗体。因此，合成了与磷酸化位点（THR56）相似的肽（AragetrftDtrKD）与EF-2相关的氨基酸序列（THR56）合成，将CYS添加到N末端，并且与载体倾斜合并（与携带者的冲突结合）（ KLH）。从获得的抗血液中改进了抗体，并尝试使用该抗体检测大鼠EF-2。由于磷酸化的差异，从大鼠组织中制备的EF-2通过不同的电子游泳方法分离，然后使用产生的抗肽抗体进行imanobrot，并进行磷酸化的EF-2和非磷检测到氧化物。这项研究中产生的抗肽抗体可用于测量大鼠EF-2的磷酸化，并可以通过检查EF-2的磷酸化状态来预测EF-2的活性。