植物細胞における病原菌認識装置の分離とそれらの再構成に関する基礎的研究

植物细胞中病原体识别装置的分离及其重建的基础研究

基本信息

批准号：
11760036
负责人：
豊田和弘
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

植物-病原菌の相互作用における宿主特異性決定機構の解明は、自他識別という生命現象の根幹に迫りうる課題であり、幾多の応用的価値を秘めている。植物の感染病をモデルとすれば、感染の成立(罹病化)、または拒絶(抵抗化)が特異性決定の指標となる。これまでに、エンドウー褐紋病菌Mycosphaerella pinodesをモデルとして、病原菌に対する認識は先ず宿主の細胞壁で行われ、下流の原形質膜シグナル伝達系が制御されていることが次第に明らかとなってきた。そこで、本研究では、細胞壁における病原菌認識と、これに引き続く情報伝達の流れを明らかにすることを目的とした。すなわち、エンドウ細胞壁ならびに原形質膜可溶化タンパク質から病原菌シグナル物質(サプレッサー、エリシター)に対して応答する分子(酵素活性)を探索し、エンドウcDNAライブラリーからそれらのクローニングを行った。一方、大腸菌で発現させた組み換えタンパク質を抗原としてポリクローナル抗体を作製するとともに、ビオチン標識、またはそれらを固相化したアフィニティーゲル担体を作製し、シグナル伝達系における相互作用分子の探索を進めた。この結果、原形質膜シグナル伝達系を構成するリピッドキナーゼ(組み換えタンパク質)を直接リン酸化する原形質膜タンパク質の存在が明らかとなった。また、分離原形質膜におけるリピッドキナーゼはエリシターで活性化し、逆にサプレッサーやタンパク質リン酸化酵素阻害剤の存在下には著しく抑制されたことから、本リン酸化酵素は原形質膜から細胞内部への情報伝達に深く関与しているものと推定された。現在、本酵素の上流で働くタンパク質の精製・解析を進めてる。

阐明植物与病原菌相互作用中宿主特异性决定机制，是一个能够从根本上解决自体-他人歧视的生物学现象的问题，具有许多实用价值。如果使用植物传染病作为模型，感染（易感性）或排斥（抗性）的建立是确定特异性的指标。迄今为止，以豌豆褐斑病菌Mycosphaerella pinodes为模型，越来越清楚地认识到病原体的识别首先发生在宿主细胞壁中，并且下游质膜信号转导系统受到调节。因此，本研究的目的是阐明细胞壁中的病原体识别以及随后的信息传递流程。也就是说，我们从豌豆细胞壁和质膜溶解蛋白中寻找对病原体信号物质（抑制子、激发子）有反应的分子（酶活性），并从豌豆cDNA文库中克隆它们。另一方面，我们以大肠杆菌表达的重组蛋白为抗原制备了多克隆抗体，并制备了生物素标记或固定化的亲和凝胶载体，并继续寻找信号转导系统中的相互作用分子。结果，揭示了直接磷酸化构成质膜信号转导系统的脂质激酶（重组蛋白）的质膜蛋白的存在。此外，分离的质膜中的脂质激酶被激发子激活，但相反，它们在抑制子和蛋白激酶抑制剂存在下被显着抑制，表明该激酶从质膜到细胞内部被激活。据推测，他们深入参与了信息传递。目前，我们正在对该酶上游的蛋白质进行纯化和分析。