免疫化学的手法による活性汚泥スカム化過程の解析

免疫化学方法分析活性污泥浮渣形成过程

基本信息

批准号：
11750494
负责人：
宮田直幸
金额：
$ 1.47万
依托单位：
University of Shizuoka
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、活性汚泥やスカムにおけるスカム原因菌(ミコール酸含有菌)の挙動解析を最終目的として、スカム中に優占するミコール酸含有菌の検出・同定法を検討した。Gordonia(Ncardia)amaraeミコール酸(平均炭素数52.0)より作製された抗ミコール酸抗体は、G.amaraeをはじめとする種々のミコール酸含有菌に結合する。そこで本抗体を用いた免疫磁気ビーズ法によりスカム原因菌を回収できれば、その特徴付けが可能であると考え、以下の基礎的検討を行った。免疫磁気ビーズ法によりG.amarae菌体の回収を検討したところ、10^4〜10^6CFU/mlの菌体を90%以上の収率で回収できた。また、Rhodococcus属及びTsukamurella属についても回収可能であった。次に、回収したスカム原因菌の同定を目的として、ミコール酸の分析と16s rRNA遺伝子配列の解析を検討した。ミコール酸の分析では、薄層クロマトグラフィーによる半定量法を確立すると共に、GC/MS分析条件の最適化を行った。本法は、これまでにスカム原因菌として報告されたGordonia属、Nocardia属及びRhodococcus属の菌株に適用できた。また、16s rRNA遺伝子配列の解析では、ミコール酸含有菌からのゲノムDNAの抽出には、Chelex法が効果的であることを明らかにした。スカムより単離されたミコール酸含有菌(以前に生理学的試験よりG.amaraeと同定された)からChelex法によりDNAを抽出し、16s rRNA遺伝子をPCRで増幅後シーケンシングを行った。その結果、約1400bpの配列が決定され、他の菌株との相同性により本菌がG.amaraeであると同定された。以上の結果より、免疫磁気ビーズ法による菌体の回収とそのミコール酸及び16s rRNA遺伝子の解析により、スカム中に優占するスカム原因菌の詳細な特徴付けが可能であると結論づけた。

在本研究中，我们研究了检测和识别浮渣中占主导地位的含分枝菌酸细菌的方法，最终目标是分析活性污泥和浮渣中产生浮渣的细菌（含分枝菌酸细菌）的行为。由 Gordonia (Ncardia) amarae 分枝菌酸（平均碳数 52.0）制备的抗分枝菌酸抗体可与包括 G. amarae 在内的各种含分枝菌酸的细菌结合。因此，我们认为，如果可以使用该抗体通过免疫磁珠法回收浮渣细菌，则可以对其进行表征，因此我们进行了以下基础研究。当我们使用免疫磁珠法检查G.amarae细胞的回收率时，我们能够回收10^4至10^6 CFU/ml的细胞，收率超过90%。此外，红球菌属和冢村氏菌属也可回收。接下来，为了鉴定回收的浮渣细菌，我们进行了分枝菌酸分析和16s rRNA基因序列分析。对于霉菌酸的分析，我们建立了薄层色谱半定量方法，并优化了 GC/MS 分析条件。该方法适用于戈登氏菌属、诺卡氏菌属和红球菌属菌株，这些菌株已被报道为引起浮渣的细菌。此外，对16s rRNA基因序列的分析表明，Chelex方法对于从含有分枝菌酸的细菌中提取基因组DNA是有效的。采用Chelex法从浮渣中分离出的含有分枝菌酸的细菌（之前通过生理测试鉴定为G. amarae）中提取DNA，通过PCR扩增16s rRNA基因并测序。结果确定了约1400 bp的序列，根据与其他菌株的同源性，将该细菌鉴定为G. amarae。基于上述结果，我们得出结论，通过使用免疫磁珠法收集细菌细胞并分析其分枝菌酸和16s rRNA基因，可以对浮渣中占主导地位的浮渣细菌进行详细表征。