トランスジェニック緑藻を用いた光化学系IIの結晶化と解析

使用转基因绿藻进行光系统 II 的结晶和分析

• 批准号: 11740451
• 负责人: 皆川 純
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11740451/
• 关键词: 光合成; 結晶; 緑藻; クラミドモナス; 光化学系I I; 部位特異的変異; 脂質

本助成金を用いて光合成光化学系IIの結晶化を試みた。オハイオ州立大において、生物試料に関してはR.Sayreと、リピッド・キュービック・フェーズ(LCP)法に関してはM Caffereyと共同し研究は進んだ。その結果非常に微細だが結晶を得ることができた。その後、保持活性を向上させること、解析に耐えうる結晶を得るためLCP法を改良することに取り組んでいる。以下に要約する。まず、LCP法の予備実験として,モノオレイン/ドデシルマルトシド系の相転移について調べた結果、光化学系II標品を通常可溶化状態に保持するために添加している0.03%という濃度のドデシルマルトシド存在下でも連続型LCP(Pn3mまたはla3d)が安定に存在しうることが明らかとなった。次に、私たちがすでに確立した全く新しい方法を用い、大容量藻類培養装置を使い、形質転換緑藻であるクラミドモナスからヒスチジンタグ法により光合成光化学系II標品を大量に精製した。続いて、光合成光化学系II標品を0.03%のドデシルマルトシドに可溶化したまま、モノオレインとさまざまな条件で混合し、安定にLCPに封じ込める条件を見出した。ただ、このLCPに封入した段階で光化学系IIは部分的に活性を失うことも判明したため、モノオレインだけでなく、これにクラミドモナス内在性の脂質であるPE,PC,MGDG,DGDGなどを活性保持のため混合することを検討した。そしてこれら脂質混合物もLCPに封入する方法を確立した。モノオレイン単独のLCPにおいて多数の微細結晶を得たが、現在のところX線による解析には耐えない。

使用此赠款，我们试图使光合光系统II结晶。在俄亥俄州立大学，研究与R. Sayre进行了生物样品和M Cafferey的脂质立方相（LCP）方法的进行。结果，尽管非常好，但获得了晶体。之后，我们正在努力改善保留活性并改善LCP方法，以获得可以承受分析的晶体。下面总结了它。首先，作为LCP方法的初步实验，我们研究了monoolein/doetecylmaltoside系统的相过渡，发现连续的LCP（PN3M或LA3D）即使在十二烷基 - 马尔替糖苷浓度的情况下也可以稳定存在，即使在0.03％的情况下存在，这添加了soldystem II solubiels in solubielsize sontystem in solubielsize sontecy is photosystem ii。接下来，使用我们已经建立的全新方法，我们使用组氨酸标签方法使用大量的藻类培养装置纯化了从Chlamydomonas（一种转化的绿色藻类）纯化大量的光合光系统II制剂。随后，在各种条件下将光合光合系统II制剂与Monoolein混合在一起，同时仍将溶解在0.03％的十二烷基马尔替型中，并发现条件稳定地包含在LCP中。但是，还发现，当封装在该LCP中时，光系统II失去了部分活动，因此我们不仅研究了Monoolein的混合，还研究了内源性脂质PE，PC，MGDG，DGDG等，以维持活性。已经建立了将这些脂质混合物封装在LCP中的方法。单独使用Monoolein LCP获得了许多细晶体，但目前无法承受X射线分析。

项目成果

Hatano-Iwasaki,A.,Minagawa,J.,Inoue,Y.,Takahashi,Y.: "Two functionally distinct Mn clusters were formed by introducing a mutation in the carboxyl-terminus of a photosystem II reaction center polypeptide, D1, of the green alga Chlamydomonas reinhardtii"Bio

Hatano-Iwasaki,A.、皆川 J.、井上 Y.、高桥 Y.：“通过在光系统 II 反应中心多肽 D1 的羧基末端引入突变，形成了两个功能不同的 Mn 簇。

Hatano-Iwasaki A.,Minagawa J.,Inoue Y.,Takahashi Y.: "Characterization of chloroplast psbA transformant of Chlamydomonas reinhardtii with impaired processing of a precursor of a photosystem II reaction center protein,D1"Plant Mol.Biol.. 42. 353-363 (2000)

Hatano-Iwasaki A.、Minakawa J.、Inoue Y.、Takahashi Y.：“莱茵衣藻叶绿体 psbA 转化体的表征，其光系统 II 反应中心蛋白前体加工受损，D1”植物分子生物学.. 42