大腸癌モデルマウスを用いた遺伝子治療の基礎実験

结肠癌模型小鼠基因治疗基础实验

• 批准号: 10770636
• 负责人: 菅野 雄介
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Jikei University School of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10770636/
• 关键词: 大腸癌モデルマウス; 遺伝子治療; Min mouse; APC遺伝子; 大腸腺腫; Adeno Virus; 肝細胞成長促成因子HCG; Cre; loxP system; 切除後肝再生補助

APC遺伝子のexon 1から14までの約2キロベースをmRNAからRT PCRで増幅する。正常マウスの腸管からIso-gen kitを用いてmRNAを抽出し、逆転写酵素でcDNAを作製する。exon 1から14に特異的な塩基配列にSubcloningしやすい様に制限酵素のsiteを付加したPCRプライマーを作成し、GeneAmp Kitを用いてPCRを行ない正常マウスAPC遺伝子exon 1〜14を増幅する。pCMV-Flag Plasmid にレポーター遺伝子Flag 蛋白とAPC遺伝子が接合するようにSubcloningする。同時にexon 15に特異的なPCRプライマーを作成し、exon 15を増幅し、上記のPlasmidに結合し、APC遺伝子8535ベース全長を構築する。Adeno Virus Expression kitを用いて、Flag-APC遺伝子をコスミドベクターに導入する。Cre遺伝子を組み込んだコスミドベクターと制限酵素処理済みDNA-TPCとを293細胞にco-transfectにより導入し、相同組換えを起こし非増殖型の組換えアデノウイルスを得る。現在、再考を加えつつ導入遺伝子を作製中である。

通过 RT PCR 从 mRNA 中扩增出 APC 基因外显子 1 至 14 的大约 2 kb 碱基。使用 Iso-gen 试剂盒从正常小鼠的肠道中提取 mRNA，并使用逆转录酶创建 cDNA。创建 PCR 引物，在外显子 1 至 14 特异的碱基序列上添加限制性酶位点以促进亚克隆，并使用 GeneAmp Kit 进行 PCR 扩增正常小鼠 APC 基因外显子 1 至 14。将报告基因Flag蛋白和APC基因亚克隆至pCMV-Flag质粒中。同时，制作外显子15特异的PCR引物，扩增外显子15，与上述质粒结合，构建全长APC基因8535碱基。使用腺病毒表达试剂盒将 Flag-APC 基因引入粘粒载体。将掺有Cre基因的粘粒载体与限制性内切酶处理的DNA-TPC共转染至293细胞中，发生同源重组，获得非复制型重组腺病毒。目前，我们正在重新考虑情况，同时创建转基因。