大腸菌supFを標的遺伝子とした変異スペクトル解析用トランスジェニックマウス系の樹立

建立针对大肠杆菌supF的突变谱分析转基因小鼠系

基本信息

批准号：
09780487
负责人：
布柴達男
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09780487/
关键词：
突然変異スペクトル supF遺伝子活性酸素(OH・)塩化コバルト 8-oxoG

项目摘要

今年度は、昨年度確立に成功した変異supF遺伝子を確実に選択可能な変異体選択システムを用い、大腸菌の自然および誘発突然変異のスペクトルを検討すること、トランスジェニックマウス系の予備実験として、SupFをゲノムにもつ哺乳類細胞変異スペクトル解析系の樹立を目的とした。成果1)M13ファージを用いたssDNAの調整を可能にすることで、変異選択後のシーケンスをスムースに行えるように、M13ファージの複製開始点であるf1 oriを導入した新しいplasmidpTN89を作成し、このplasmidと昨年度確立した変異選択システムを用い、活性酸素の消去酵素と鉄の取り込み調節タンパク質欠損大腸菌に生じる自然突然変異スペクトルを検討し、活性酸素による代表的なDNA損傷である8-oxoGに由来すると見られる、GC>>TA、AT>>OGが有意に増加することを確認した(布柴ら、1998;Obata et al.,1998)。成果2)また同様の系により発ガン性重金属のコバルトが誘発する変異スペクトルを解析した(Ogawa et al.,in press)。成果3)現在さらにこの系を応用し、標的supF遺伝子をplasmidの複製方向に対して、順・逆向きに導入した2種のplasmidを新たに作成し、突然変異の固定における複製鎖特異性を塩基レベルで解析する系を樹立した。活性酸素による代表的なDNA損傷である8-oxoGの修復系を欠いたmutMmutY株、ヌクレオチドプールの8-oxodGTPの分解系を欠いたmutT株を用い、DNAに8-oxoGがある場合の変異の固定に複製鎖特異性があるか否か、プールに存在する8-oxodGTPの取り込みに複製鎖特異性があるか否かを検討している。成果4)supF(+)をマーカーとしてのneo遺伝子とともに挿入されたλファージZAPII/supFneoを作成し、そのDNAをマウス乳がん細胞由来のFM3Aに導入し、哺乳類細胞変異スペクトル解析系の構築を試みた。ネオマイシン抵抗性を指標に、トランスフェクションされた細胞計11株について、PCR法とサザン法により、マウスゲノム中に取り込まれたλDNAおよびsupFのコピー数を推定したところ、突然変異解析系として用いるには十分なコピー数の細胞株は得られなかった。おそらくは、amber codonに対してTyrを挿入することでamber変異をサプレスするというsupFの性質が、amber終始コドンへのTyrの挿入を起こし、多コピー存在すると致死的に働くため、突然変異解析系として好ましいsupFが多コピー存在する細胞の樹立が困難であるものと思われる。

今年，我们旨在使用突变选择系统研究大肠杆菌中的天然和诱导突变谱，该系统允许可靠地选择去年建立的突变体SUPF基因，并在其基因组中用SUPF在其基因组中建立了对转基因小鼠系统的初步实验，并在其基因组中建立了SUPF。结果1）通过使用M13噬菌体启用ssDNA调整，我们创建了一个带有F1 ORI的新质粒化89，即M13噬菌体的复制的起源，以在选择突变后平稳进行测序。 Using this plasmid and the mutation selection system established last year, we investigated the spontaneous mutation spectrum that occurs in Escherichia coli, which lacks active oxygen elimination enzymes and iron uptake regulatory proteins, and confirmed that GC>>TA and AT>>OG, which are believed to be derived from 8-oxoG, a typical DNA damage caused by reactive oxygen (Fushiba et al., 1998; Obata等人，1998年）。结果2）我们还分析了通过使用类似的系统（在Press中）使用类似的系统，通过使用类似的系统来分析由致癌重金属钴诱导的突变光谱。结果3）使用此系统，我们现在创建了一个系统，该系统通过在质粒复制方向引入靶标SUPF基因来分析基本水平的复制链的特异性。我们已经使用了缺乏8-oxog修复系统的杂种菌株，这是由活性氧引起的典型DNA损伤以及缺乏核苷酸池中8-氧化物降解系统的降解系统的杂种菌株，以及在DNA中是否存在8-oxog的固定性，是否存在复制的特异性，是否存在8-Oxog的固定性，以及是否存在dna的固定性。出现在游泳池中。结果4）我们用与NEO基因一起作为标记的SUPF（+）创建了λ噬菌体Zapii/supfneo，并将DNA引入了源自小鼠乳腺癌细胞的FM3A中，并试图构建哺乳动物的细胞突变谱分析分析系统。使用新霉素的耐药性作为指标，通过PCR和Southern方法估算了λDNA和SUPF的复型数量，并且未获得足够拷贝数的细胞系作为突变分析系统。 SUPF的性质很可能通过将TYR插入琥珀色密码子中抑制琥珀色突变，这会导致Tyr在整个琥珀色的整个密码子中插入密码子，并且当存在多个副本时会致命，这使得很难用多个SUPF建立细胞，这是一个优选的突变分析系统。