ヒト好中球における新しい細胞内顆粒の超微形態学的解析

人中性粒细胞新胞内颗粒的超形态分析

• 批准号: 09770016
• 负责人: 瀧澤 俊広
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Jichi Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09770016/
• 关键词: ヒト好中球; 細胞内顆粒; GPIアンカー型蛋白質; アルカリ性フォスファターゼ; 好中球アルカリフォスファターゼスコア; 組織化学; 電子顕微鏡; 細胞生物学; 細胞化学・; 凍結割断レプリカ法

本研究の目的は、ヒト好中球の細胞内顆粒、特に従来の特殊顆粒とは異なるGPI(glycosyl-phosphatidylinositol)アンカー型蛋白質を含む新しい細胞内顆粒の特徴を明らかにすることである。特定の細胞内顆粒膜上に微量に存在するGPI蛋白分子(alkaline phosphatase(ALPase),CD16等)を高い解像力で同定し、その分布様式・動態を明らかにできる新しい形態学的解析法“レプリカ細胞化学(freeze-fracture cytochemistry)"を開発し、その解析を進めた。この手法を用いてGPI蛋白分子の分布様式を検討してみると、非刺激時にはALPaseは細胞内小顆粒の内表面に限局していること、又CD16は細胞内小顆粒と細胞膜表面の両方に分布していること等のGPI蛋白分子のユニークなトポロジーを初めて明らかにすることができた。次に凍結超薄切片を用いた好中球の組織化学により、GPI蛋白分子(ALPase)を含む小顆粒がエンドソーム(endosome)とは異なる細胞内小器官であることを確認した。又、更に形態学的解析を進めるために、蛍光顕微鏡で観察した蛍光シグナルを引き続き電子顕微鏡で直接観察する“correlative microscopy"法も開発した。一方、fMLP等の刺激に対するGPI蛋白分子、特にALPaseの動態解析を進めるために、従来のアゾ色素法とは異なるセリウム法を用いた高感度でしかも安定性のある光顕ALPase染色法を開発した。これにより、刺激後細胞内から細胞表面に急速にup-regulateされるダイナミックな動態変化をとらえることに成功した。この新しい染色法は、基礎医学的研究に留まらず、臨床においてより精度の高いNAPscore(neutrophil alkaline phosphatase score)検査法開発の有力な糸口となると考えられる。このように頂いた科研費により、ヒト好中球細胞内顆粒の超微形態学的特徴をかなりの部分まで明らかにすることができたが、骨髄中の成熟過程にある好中球でどの様にGPI蛋白分子が発現しているのか、分子生物学的解析が課題として残された。

这项研究的目的是表征人类嗜中性粒细胞的新细胞内颗粒，尤其是含有GPI（糖基 - 磷脂酰肌醇）锚固型蛋白质的新细胞内颗粒，它们与常规特殊颗粒不同。我们开发了一种称为“复制细胞化学”的新形态分析方法，它可以鉴定GPI蛋白分子（碱性磷酸酶（ALPase），CD16等），这些分子以较小的量子存在于特定的细胞内颗粒中，并具有高分辨率，并以高分辨率和阐明其分布模式和动力学，并进行分析。使用这种技术，我们能够首次澄清GPI蛋白分子的独特拓扑，例如，在不刺激过程中，ALPase位于小细胞内颗粒的内表面，并且该CD16分布在小的细胞内颗粒和细胞膜的表面上。接下来，使用冷冻超薄切片的中性粒细胞组织化学证实，含有GPI蛋白分子（ALPase）的小颗粒是与内体不同的细胞内细胞器。为了进一步推进形态分析，还开发了一种“相关显微镜”方法，其中电子显微镜继续直接观察到通过荧光显微镜观察到的荧光信号。另一方面，为了进一步分析刺激FMLP等刺激的GPI蛋白分子的动力学，是一种与常规AZO DYE方法不同的高度敏感且稳定的轻尺度ALPase染色方法，这是一种不同的。这导致成功检测动态动态变化，这些变化在刺激后从细胞内到细胞表面迅速上调。这种新的染色方法被认为是开发更准确的NAP评分（中性碱磷酸酶评分）测试方法的有前途的线索，不仅是基本的医学研究，而且在临床上也是如此。授予的科学研究资金使我们能够在很大程度上阐明人类中性粒细胞内细胞内颗粒的超细形态特征，但是分子生物学分析仍然是一个挑战，即看到GPI蛋白分子如何在骨髓成熟过程中的中性粒细胞中表达。

项目成果

Toshihiro Takizawa: "Correlative microscopy using fluoronanogold on ultrathin cryosections:proof of principle." J Histochem Cytochem. 46・10. 1097-1102 (1998)

Toshihiro Takizawa：“在超薄冷冻切片上使用荧光纳米金的关联显微镜：原理证明。”J Histochem Cytochem 46·10（1998）。

Toshihiro Takizawa: "Ultrastructural localozation o f enzymes in biomembranes as revealed by new enzyme cytochemical techniques." Acta Anat Nippon. 73・1. 1-7 (1998)

Toshihiro Takizawa：“新酶细胞化学技术揭示了生物膜中酶的超微结构定位”，Acta Anat Nippon 73·1（1998）。

Toshihiro Takizawa: "Freeze-fracture enzyme cytochemistry reveals the distribution of enzymes in biological membranes : Enzyme cytochemical label-fracture and fracture-label." Acta Histochem Cytochem. 30・1. 77-84 (1997)

Toshihiro Takizawa：“冷冻断裂酶细胞化学揭示了生物膜中酶的分布：酶细胞化学标签-断裂和断裂-标签。”Acta Histochem Cytochem 30・1（1997）。

瀧澤 俊広: "好中球における新しい細胞内顆粒-レプリカ細胞化学を用いた電顕細胞化学的解析-" 週間 医学のあゆみ. 187・3. 178-179 (1998)

Toshihiro Takizawa：“中性粒细胞中的新细胞内颗粒 - 使用复制细胞化学进行电子显微镜细胞化学分析”《医学史周刊》187・3（1998）。

瀧澤 俊広: "新しい好中球アルカリフォスファターゼスコア(NAP score)検査法の地域病院におけるシステム化の検討." 月刊地域医療. 12・4. 250-256 (1998)

泷泽敏宏：“地方医院新中性粒细胞碱性磷酸酶评分（NAP评分）测试方法的系统化研究”，《社区医学月刊》12・4（1998）。