P19細胞および網膜細胞の分化系におけるNotchシグナル伝達経路の解明

P19细胞和视网膜细胞分化系统中Notch信号通路的阐明

• 批准号: 08780710
• 负责人: 岡 千緒
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08780710/
• 关键词: 細胞運命決定; 側方抑制; 分子生物学

1.DII1-Notch1-Hes1シグナルの検出系の確立yeast two hybrid system及びPCRによってNotch1、DII1のcDNA及びHes1 promoterを単離した。これらを用いてサイトメガロウイルスのプロモーターの下流にNotch1,DII1のcDNAをつないだconstruct(pCDNA3-Notch1,pCDNA3-DII1)およびHES1のプロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子をつないだconstruct(pGVB-HES1)を作成した。現在はNIH3T3細胞にpCDNA3-DII1を導入しDII1がゲノム中に組み込まれた9クローンについてDII1蛋白の過剰発現を確認中である。P19細胞にpCDNA3-Notch1を導入した細胞については、何度かのスクリーニングを行ったが得られておらず、Notch1蛋白の過剰発現が細胞にtoxicである可能性がある。今後は、一過性発現による系及び、テトラサイクリンによるinducibleな系でのNotchの過剰発現を試みる予定である。2.変異型のNotch1,DII1蛋白質のNotchシグナル伝達系に及ぼす影響の検討Dominant negative型として働くと推測される変異型Notch1,DII1の発現ベクターを作成した。1の系が確立すれば変異型の蛋白の影響を検討する。3.Notchシグナルの関与の検討Notch1及びDII1の細胞外部分に対するポリクローナル抗体を作成した。これらの抗体により、網膜細胞、胸線細胞、骨髄細胞が染色されることより、その分化過程にNotchシグナルが関与することが示唆される。今後どのような細胞系列がNotchあるいはDII1を発現しているかを検討し、Notchシグナルの増減による分化への影響を調べる。

1。建立DII1-NOTCH1-HES1的检测系统，通过酵母两杂交系统和PCR分离Notch1，Dii1和Hes1启动子的cDNA。使用这些构建体（PCDNA3-NOTCH1，PCDNA3-DII1）是通过连接Hes1下游的Notch1和Diii1的CDNA来创建巨细胞病毒启动子的下游和构建体（PGVB-HES1）的。目前，在九个克隆中证实了DII1蛋白的过表达，其中PCDNA3-DII1被引入NIH3T3细胞中，并将DII1纳入基因组中。已经筛选了几次用PCDNA3-NOTCH1引入到p19细胞中的细胞，而Notch1蛋白的过表达可能对细胞有毒。将来，我们计划尝试通过四环素在瞬时表达的系统和诱导系统中过度表达凹槽。 2。检查突变体Notch1和Dii1蛋白对Notch信号系统的影响，我们为突变体Notch1和dii1创建了一个表达矢量，被认为是主要的负类型。一旦建立了1系统，将研究突变蛋白的作用。 3。编制了对Notch1和DII1的细胞外部分的Notch信号的参与。这些抗体染色的视网膜细胞，乳腺细胞和骨髓细胞，表明缺口信号参与分化过程。将来，我们将检查哪些细胞系表示Notch或DII1，并研究增加或减少Notch信号对分化的影响。