ラット網膜培養系における神経細胞の分化の研究

大鼠视网膜培养系统神经元分化的研究

• 批准号: 08771521
• 负责人: 朝蔭 博司
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Kyorin University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08771521/
• 关键词: HPC-1; syntaxin; 網膜細胞培養

HPC-1/syntaxin 1Aは、ラット海馬細胞膜特異抗原として赤川らにより報告されたC末端に膜貫通部位を有する分子量35kDの膜蛋白質で、シナプス前膜におけるexocytosisへの関与が注目されている。一方、単層培養系ではすでに神経細胞発芽を抑制的にコントロールすることが示唆されている。本研究において、出生直後のWistarラットの網膜細胞を再凝集培養し、その組織を光顕像および免疫組織染色により確認した。また、培養過程におけるHPC-1の発現量をWestern blot法により検討した。1,実験方法:(1)細胞培養:出生24時間以内のWistarラットより網膜のみを単離し、Ca Mg free HANKS液内で網膜細胞を分離させインキュベータ-内で再凝集培養した。(2)組織検索:細胞塊はエポン包埋し切片を作成した。切片はトルイジンブルー染色し光顕で観察した。また、他の再凝集培養塊は4%PFAで固定した後、クライオスタットで凍結切片を作成した。一次抗体として、ポリクローンHPC-1抗体およびモノクローンチュブリン抗体を各切片に反応させた後それそぜに、二次抗体としてロ-ダミンでラベルした抗ウサギIgG抗体およびFITCでラベルした抗マウスIgG抗体を反応させ、蛍光顕微鏡下で観察した。(3)Western blot法によるHPC-1発現量:培養1日目および7日目の培養細胞をBuffer(1%NP-40 1mM EDTA 1mM DTT 0.1mM PMSF/PBS)内で溶解しサンプルを得た。各サンプルのHPC-1の発現をチュブリンをコントロールとし、型のごとくWestern blot法にて確認した。2,結果:トルイジンブルー染色され切片は層構造を呈しており、免疫組織染色でチュブリン抗体は、再凝集細胞塊全体に分布するのに対し、HPC-1抗体は切片の表層に多く分布していることが確認できた。HPC-1発現量は、培養1日目に比べ7日目のサンプルで増加していることが確認できた。

HPC-1/语法1a是一种膜蛋白，其分子量为35 kD，在Akakawa和其他人报告的C末端具有膜穿透位点为大鼠河马细胞膜特异性抗原。另一方面，在单个层次培养系统中，它已经表明神经细胞发芽被抑制。在这项研究中，重印并培养了wistar大鼠的视网膜细胞，并通过照相金和免疫组织染色确认组织。此外，通过Western印迹方法检查了HPC-1在培养过程中的表达。 1，实验方法：（1）细胞培养：仅在出生后24小时内从Wistar大鼠中分离出视网膜，视网膜细胞在CA MG无汉克斯液体中分离，并且在孵化器中重建练习和培养物。 （2）组织搜索：细胞质量创建了一个充满Epon的作品。 Turujin Blue染色和光线观察到这些碎片。此外，将其他可充电培养固定在4％PFA中后，用晶体产生了冷冻的碎片。作为一抗，多克隆HPC-1抗体和单色丘疹抗体与每种切割的抗兔IgG IgG IgG抗体和FITC反应，并在荧光显微镜下反应并观察到抗体。 （3）通过蛋白质印迹法的HPC-1表达：培养的第一个和七天的培养细胞溶解在缓冲液中（1％NP-40 1mm EDTA 1MM DTT 0.1mm PMSF/PBS），并获得了样品。每个样品的HPC-1的表达由Chewrine控制，并确认蛋白质印迹方法为一种类型。 2，结果：Turujin Blue染色和切割的片段具有层结构，免疫组织染色，而Chewrine抗体分布在整个招募细胞质量中，而HPC-1抗体通常分布在切口上。那是。已经证实，与培养的第一天相比，第七天的HPC-1表达量正在增加。