カルシウムに対する高親和性・新規EF―hand蛋白質の三次元構造解析

新型高钙亲和力 EF-hand 蛋白的三维结构分析

基本信息

批准号：
12780531
负责人：
中村彰男
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Gunma University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

平成12年度はΔN32CBP40のカルシウム非存在下での構造解析を分解能3.0Aで解析し、構造精密化により三次元構造を明らかにすることができた。13年度はカルシウム存在下での結晶化を幾度か試みたが結晶化は困難であった。そこでカルシウムをソーキング(浸透)して得られた回折強度データを用いて、差フーリエ法によりカルシウム結合状態の構造解析を行った。カルシウム非結合の構造とカルシウム結合の構造の変化はカルモジュリンの様に大きくはなかった。一つは結晶内分子間パッキングの影響で、構造変化が抑制されてしまった可能性があるが、ΔN32CBP40は、EF1/2とEF3/4の間にカルモジュリンのようなリンカーがないため、もともと両者が相互作用してコンパクトな構造になっているので、カルシウムを結合しても大きな構造変化が起こらない可能性がある。このΔN32CBP40が非常に高いカルシウムに対する親和性を持っているのは、カルシウムN末端のαヘリックスからなるcoiiled-coilドメインと球状のEF-handドメインの部分がは広範囲にわたって分子内相互作用することによるものであることも構造からわかった。さらに、カルシウムによる自己集合に関しても、確かにカルシウムを結合したときの構造変化は少ないものの、ΔN32CBP40のN末端のcoiled-coilでは、1本目のヘリックスが2本目に比べて短い。しかし、二次構造予測からは、32残基が加わると2本のヘリックスの長さがそろい、coiled-coilが安定化・長くなると予想される。そのメカニズムはCBP40全長にカルシウムが結合すると、EF-handの構造変化がドメイン間相互作用を介してcoiled-coilに伝わり、coiled-coilのヘリックス間の相対配置が変化し、それによって、分子間でcoiled-coil同士がバンドルを作って会合するのではないだろうかと考えられる。本研究で得られたデータは現在Nature Structural Biologyに投稿中である。また、更にΔN32CBP40とCaMのキメラについても結晶を得ることができ、現在構造解析中である。

在2000年，以3.0a的分辨率分析了ΔN32CBP40的结构分析，三维结构可以通过结构改进来阐明。在2013年，我们试图在钙存在下几次结晶，但是结晶很难。因此，使用通过浸泡（通心）钙获得的衍射强度数据，通过差傅立叶方法分析了钙结合状态的结构。钙毫受和钙结合的结构的变化不如钙调蛋白大。一种可能性是，由于晶体内分子间堆积的影响，结构性变化已被抑制，但是由于EF1/2和EF3/4之间的ΔN32CBP40没有像钙调蛋白一样的连接器，因此两者具有最初与彼此相互作用的紧凑结构，因此即使是主要结构的可能性也不会发生。从结构中也揭示了对钙的非常高的亲和力是由于胶圈结构域之间的分子内相互作用广泛，即钙N末端的N端的α螺旋和球状EF手部域。此外，关于由于钙引起的自组装，尽管钙结合时肯定几乎没有结构变化，但在ΔN32CBP40的N末端盘绕圈中，第一个螺旋比第二个螺旋短。但是，从二级结构预测来看，预计当添加32个残基时，两个螺旋的长度将保持一致，并且盘绕螺旋将稳定并延长。据认为，当钙与CBP40的全长结合时，EF手中的结构变化通过域间相互作用传播到盘绕螺旋，改变了盘绕螺旋线的螺旋之间的相对排列，从而导致捆绑和分子之间的捆绑。从这项研究中获得的数据目前已发布到自然结构生物学上。此外，可以为ΔN32CBP40和CAM的嵌合体获得晶体，并且目前正在进行结构分析。