膜貫通型タンパク質のNMR構造解析法の開発 -異方的構造情報の抽出-

跨膜蛋白NMR结构分析方法的开发-各向异性结构信息的提取-

基本信息

批准号：
12780503
负责人：
菊地淳
金额：
$ 0.9万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

1)異方的構造情報を駆使したタンパク質立体構造計算法の検討2つの構造的に独立なドメインからなるタンパク質のドメイン間相対配置について,異方的構造情報を駆使して立体構造を決定できることを示すことができ,国際学術誌に投稿が認められた.特に通常の水溶性タンパク質では扱いが困難な回転緩和異方性情報については,後述2,3)に示すような異方的分子形状を有する膜に結合させれば極めて有用であると期待できる.また,ワシントン大学のBaker博士との共同研究により,経験的立体構造予測法を導入し,配向情報のみで代表的なタンパク質のグローバルフォールドが決定できることがわかった.2)膜結合型両親媒性ペプチドのバイセルへの結合長,短鎖のリン脂質の割合をコントロールすることにより比較的超分子サイズの小さなバイセルを作成し,良く研究された両親媒性ペプチドであるメリチン結合させて高分解能のHSQC, NOESYシグナルを観測できることに成功した.現在国際学術誌への論文を作成中である.3)膜結合型タンパク質を配向させるための新規磁場配向二重膜の開発前述2)のバイセルは化学的に不安定であることが大きな問題である.短鎖部分を中性界面活性剤に置換した"ゲル状ミセル"によるタンパク質の磁場配向実験を試したところ,極めて広いpH,温度範囲で安定な2重膜を作成できた.4)光合成系膜タンパク質の光受容反応を追跡するための装置組み立てと初期的実験検討上述の各技術は,光合成系膜タンパク質の光受容反応追跡に応用したいと考えている.まず,2mm口径の光ファイバーを直接NMR試料管に注入し,NMR磁場内で光照射実験をできる装置を組み立てた.また,約1000kDaの巨大膜タンパク質の^<15>Nラベル体を調整し,そのTROSYスペクトルを測定したところ,表層残基は追跡できることがわかった.

1) 充分利用各向异性结构信息的蛋白质 3D 结构计算方法的研究我们证明，通过充分利用有关由两个结构域组成的蛋白质域之间的相对排列的各向异性结构信息，可以确定 3D 结构。该结果已被接受提交给国际学术期刊，特别是对于普通水溶性蛋白质难以处理的旋转弛豫各向异性信息，如下2和3）所示的各向异性分子形状非常重要。如果将其附着在具有 . 的膜上，预计将非常有用。此外，通过与华盛顿大学Baker博士的联合研究，我们引入了经验三维结构预测方法，发现仅使用方向信息就可以确定典型蛋白质的全局折叠。2）膜结合两亲物通过控制性肽与bicelle的键长和短链磷脂的比例，我们创造了超分子尺寸相对较小的bicelle，并将其与经过充分研究的两亲性肽蜂毒肽结合，获得了高分辨率图像。我们成功地观察到了 NOESY 信号。我们目前正在为国际学术期刊准备一篇论文。 3) 开发一种用于定向膜结合蛋白的新型磁性定向双膜上述 2) 中描述的 bicelle 可能在化学上不稳定。这是一个大问题，当我们使用“凝胶状胶束”对蛋白质进行磁场排列实验时，其中短链部分被中性表面活性剂取代，我们能够制造出在一定范围内稳定的双层膜。极宽的 pH 和温度范围 4) 来自光合膜蛋白的光。跟踪受体反应的设备组装和初步实验研究我们希望将上述技术应用于跟踪光合膜蛋白的光感受器反应，首先，我们将直径为2毫米的光纤直接注入核磁共振样品管中。我们构建了一个可以在磁场中进行光照射实验的装置。我们还制备了^15N标记形式的约1000 kDa的巨膜蛋白并测量了其TROSY光谱，发现可以追踪表面残基.