新しい自己免疫性水疱症と思われる粘膜限局性IgA天疱瘡における抗原の同定

粘膜局部 IgA 天疱疮（一种新的自身免疫性大疱性疾病）中抗原的鉴定

• 批准号: 10770408
• 负责人: 戸井 洋一郎
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10770408/
• 关键词: 自己免疫性水疱症; 天疱瘡; IgA天疱瘡; 免疫電顕法; 免疫スクリーニング法; デスモゾーム; 自己免疫性水痘症; 天痘症; IgA天痘症

免疫ブロット法(平成10年度)方法自己抗体の性状の確認のため、免疫ブロット法を先行した。EDTA剥離正常ヒト表皮および正常ヒト培養表皮細胞から蛋白分画を抽出し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動にて流した蛋白をニトロセルロース膜に転写する。患者血清、IgA分画のみの患者血清を1次抗体として、ABC法で反応させ、ケミルミネッセンス法にて陽性バンドを同定した。結果通常のプロット法では陽性バンドが検出されなかったため、サンプルの濃度を上げる、washingを念入りに行う、露光時間を上げる等の処置を加えたところ、200kD付近にIgAに反応する陽性バンドが認められた。しかしながらサンプル量があまりにも少量であったため陽性バンドから抽出した分画を用いた蛍光抗体間接法は施行できなかった。このことから血清中に自己抗体が存在するものと考え、次の免疫電顕法に進んだ。免疫電顕法(平成11年度)方法平成10年度から引き続き免疫電顕法を施行した。患者結膜、正常人結膜、正常人皮膚を固定した後レジン包埋した。ウルトラミクロトームにて超薄切片作製後、抗ヒトIgA抗体、患者血清を1次抗体として、ABC法を用いコロイド金にてラベリングし、透過型電子顕微鏡(JEOL,JEM-100SX)にて観察した。免疫スクリーニング法(平成11年度)方法正常ヒト結膜細胞、正常ヒト表皮細胞よりmRNAを抽出、逆転写反応にて合成されたcDNAをλgt11発現ベクターにサブクローニングする。発現ベクターを吸着させた宿主菌Y1090のコロニーのプラークリフティングを行い、精製された患者IgA分画血清を1次抗体として免疫染色を行う。陽性コロニーを取り出した後増殖、cDNAを抽出し、塩基配列を決定する。結果正常ヒト皮膚の表皮細胞間にわずかながらコロイド金のラベリングが認められた。しかしながら、ラベリングの分布特性がはっきりしなかったため、患者血清のIgA分画を用いて再度免疫電顕法を施行したが、前回以上の所見は得られなかった。原因としては患者血清中の自己抗体価が非常に低かった、あるいはサンプル量自体が少なく免疫スクリーニング法等の実験の継続が困難であったことなどが考えられる。以上のことから本患者血清には上皮細胞間の成分を認識する自己抗体分画が存在することは非常に強く示唆されるが、認識される抗原の分布特性や正常を確定するまでには至らなかった。

免疫印迹 (1998) 方法 为了确认自身抗体的特性，首先进行免疫印迹。从 EDTA 剥离的正常人表皮和正常人培养的表皮细胞中提取蛋白质级分，并将蛋白质通过 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳转移到硝酸纤维素膜上。以患者血清和仅含IgA组分的患者血清为一抗，采用ABC法进行反应，采用化学发光法鉴定阳性条带。结果，使用正常绘图方法没有检测到阳性条带，因此当我们采取诸如增加样品浓度、仔细洗涤和增加曝光时间等措施时，在200kD Ta附近观察到与IgA反应的阳性条带。然而，由于样品量太少，无法进行使用从阳性条带提取的级分的间接荧光抗体法。基于此，我们假设血清中存在自身抗体，并进行免疫电子显微镜检查。免疫电子显微镜（1999）方法 免疫电子显微镜从1998年开始延续。将患者的结膜、正常人的结膜和正常人的皮肤固定，然后嵌入树脂中。使用超薄切片机制作超薄切片后，使用抗人IgA抗体和患者血清作为一抗，通过ABC法进行胶体金标记，并使用透射电子显微镜（JEOL、JEM-100SX）进行观察。免疫学筛选方法（1999）方法：从正常人结膜细胞和正常人表皮细胞中提取mRNA，将反转录合成的cDNA亚克隆至λgt11表达载体中。对吸附有表达载体的宿主菌Y1090菌落进行噬菌斑去除，并使用纯化的患者IgA分离血清作为一抗进行免疫染色。挑出阳性菌落后，进行倍增，提取cDNA，确定碱基序列。结果，在正常人皮肤的表皮细胞之间观察到少量胶体金标记。但由于标记的分布特征尚不明确，因此使用患者血清中的IgA部分再次进行免疫电镜检查，但并未获得比前一次更好的结果。可能的原因包括患者血清中自身抗体滴度极低，或者样本量本身较少，难以继续进行免疫筛查等实验。由此可见，患者的血清中含有识别上皮细胞间成分的自身抗体成分，但所识别的抗原的分布特征和正常性尚未确定。