酵素発生活性を保持した光化学系II複合体の結晶化とX線構造解析

保留酶活性的光系统II复合物的结晶和X射线结构分析

基本信息

批准号：
09780618
负责人：
青山浩
金额：
$ 1.28万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

光化学系II複合体は複合体は光エネルギーを利用し、水分解、酸素発生という生物にとって重要な反応を触媒している。この酸素発生のメカニズムを明らかにするためには、立体構造の解明は不可欠である。そこでこの複合体の結晶化とX線回折実験を行った。昨年度は、イネの葉より精製した光化学系II標品をハンギングドロップ蒸気拡散法により結晶化を行ったところ最大0.5mm×0.5mm×0.2mmの六角板状結晶が得られた。しかしこの結晶は、c軸に垂直な方向に繊維回折パターンがあり、また不規則ならせん構造をもっており、構造解析をすすめるには非常に困難であった。またこの結晶のSDS-PAGEを行ったところ、精製標品でみられた多数のサブユニットがみられず、プロテアーゼにより分解されていた。まず最初は結晶成長後に分解がおこっていると考え、結晶が得られると直ちに液体窒素中に保存し分解の抑制を試みた。低温下でのX線回折実験は、X線損傷を防ぐにも有効であり、同一の結晶で完全なデータを収集できる。抗凍結剤条件の検索を行ったところ30%グリセロール存在下で結晶の瞬間凍結に成功した。しかしながら回折実験の結果、5Aの回折点が確認されたが、室温での測定と同様に分解に由来すると思われる繊維回折と不規則ならせん構造が確認された。このことから複合体の分解は結晶成長後に起こっているのではなく精製後、少しずつ分解が始まっていると考えられる。そこでプロテアーゼインヒビターを加えた結晶化条件の検索を行った。精製標品に種々のプロテアーゼインヒビターを加え分解抑制の効果を検討したところ、5mM EDTA、2mM N-エチルマレイミド、3%ベンズアミジンが有効であった。このうちベンズアミジンを加えた標品から0.2mm×0.1mm×0.1mmの結晶が得られた。現在この結晶のX線回折実験を行っている。

光系统II复合物利用轻能并催化生物的重要反应：水分解和氧气产生。为了阐明氧气产生的机制，必须澄清三维结构。因此，进行了该复合物和X射线衍射实验的结晶。去年，使用悬挂液蒸气扩散方法将从稻叶纯净的光系统II制剂结晶，以获得最大0.5mm x 0.5mm x 0.2mm的六边形板状晶体。但是，该晶体在垂直于C轴的方向上具有纤维衍射模式，并且具有不规则的螺旋结构，因此很难进行结构分析。此外，当在该晶体上进行SDS-PAGE时，找不到纯化标本中的许多亚基，并且晶体被蛋白酶降解。首先，我们认为分解发生在晶体生长后，当获得晶体时，我们立即将其存储在液氮中以试图抑制分解。低温下的X射线衍射实验也有效防止X射线损伤，从而可以在同一晶体上收集完整的数据。搜索抗冻剂条件，并在30％甘油存在下成功地冷冻晶体。然而，衍射实验证实了5a的衍射点，但如在室温，纤维衍射和不规则的螺旋结构所测量的那样，被认为是源自分解的。这表明晶体生长后不会发生复合物的分解，而是在纯化后开始缓慢分解。因此，通过添加蛋白酶抑制剂进行了搜索结晶条件。当将各种蛋白酶抑制剂添加到纯化的制剂中时，研究了抑制降解的作用，5mm EDTA，2mm N-乙基甲米酰亚胺和3％苯甲酰胺有效。其中，从含有苯甲胺的制剂中获得了0.2 mm x 0.1 mm x 0.1 mm的晶体。当前，正在对此晶体进行X射线衍射实验。