酵素センサータンパク質FixLのヘム・キナーゼ間情報伝達機構の解明

阐明酶传感器蛋白FixL的血红素激酶信号传递机制

基本信息

批准号：
09780617
负责人：
田村浩二
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

FixL/Jは根粒菌に含まれるタンパク質で、窒素固定反応の制御に関与している。窒素固定反応は低酸素濃度の時のみ起こる。これは酸素センサータンパク質FixLが酸素濃度の減少を感知するとレギュレータータンパク質FixJがリン酸化され、窒素固定関連遺伝子fixK、nifAのプロモーター部分に結合するためである。このFixL/Jは、"two-component system"と呼ばれる細胞内情報伝達系の典型的な例である。酸素センサータンパク質FixLのヘム・キナーゼ間情報伝達は、最終的にFixJとDNAとの正確な結合という形で具現化される。本年度はそのメカニズムに迫るべく研究を行った。FixJのC末端側(FixJC)はDNA結合ドメインを構成しており、その立体構造をNMRを用いて解明した。この構造をもとに、DNA存在下でのNMR測定、蛍光偏光度測定などを行い、FixJのDNA結合に寄与するアミノ酸残基を特定し、結合メカニズムを明らかにすべく研究を進めた。DNA存在下、非存在下で^<15>NラベルされたFixJCの2次元^1H-^<15>NHSQCスペクトル測定を行い、アミドプロトンのクロスピークがシフトしたアミノ酸残基の同定を試みた結果、Ser44のシグナルに明らかな変化が認められた。次に蛍光物質(FITC)ラベルされたDNAとFixJの変異体を用いて蛍光偏光度測定を行った。Ser44の変異体は蛍光偏光度測定ではDNAとの結合に対する影響が見られなかったので、これが位置している4番目のαヘリックス(α4)上に存在する電荷を持つアミノ酸残基(Arg、Glu)に着目して変異体を調製した。その結果、DNAとの結合に関与しているという結果が得られた。Ser44は、DNA結合に関与するArg46と水素結合しているため、構造変化の際に影響を受け、NMR測定におけるクロスピークの変化をもたらしたと結論した。

FIXL/J是根瘤菌中发现的蛋白质，参与控制氮固定反应。仅当缺氧浓度低时，氮固定反应才会发生。这是因为当氧气传感器蛋白固定感觉降低氧浓度时，调节蛋白fixJ被磷酸化并与氮固定相关基因固定剂NIFA的启动子部分结合。该fixl/j是称为“两个组件系统”的细胞内信号系统的典型示例。氧气传感器蛋白固定的血红素激酶信号传导最终以FixJ与DNA的精确结合形式体现。今年，我们进行了研究，以仔细研究该机制。 FIXJ（FIXJC）的C末端构成DNA结合域，并使用NMR阐明了其三维结构。基于这种结构，进行了DNA和荧光极化测量的NMR测量结果，并进行了研究以鉴定有助于FIXJ中DNA结合的氨基酸残基，并阐明结合机制。测量了二维 ^1H - ^<15> nHsQC光谱在存在和不存在DNA的情况下，标记为fixJC的二维nhsqc光谱被测量，并且具有酰胺质子质子交叉峰的氨基酸残基发生了变化，揭示了Ser44信号的明显变化。然后使用荧光物质（FITC）标记的DNA和FIXJ突变体进行荧光极化测量。由于Ser44突变体通过荧光极化测量对与DNA的结合没有影响，因此通过重点关注存在于第四个α-螺旋（α4）上的含电荷氨基酸残基（ARG，GLU）来制备突变体。结果表明，它与与DNA的结合有关。得出的结论是，Ser44是氢键与ARG46的氢键，该ARG46与DNA结合有关，并在结构变化过程中受到影响，从而导致NMR测量值的交叉变化。