酵素センサータンパク質FixLのヘム・キナーゼ間情報伝達機構の解明

阐明酶传感器蛋白FixL的血红素激酶信号传递机制

基本信息

批准号：
09780617
负责人：
田村浩二
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

FixL/Jは根粒菌に含まれるタンパク質で、窒素固定反応の制御に関与している。窒素固定反応は低酸素濃度の時のみ起こる。これは酸素センサータンパク質FixLが酸素濃度の減少を感知するとレギュレータータンパク質FixJがリン酸化され、窒素固定関連遺伝子fixK、nifAのプロモーター部分に結合するためである。このFixL/Jは、"two-component system"と呼ばれる細胞内情報伝達系の典型的な例である。酸素センサータンパク質FixLのヘム・キナーゼ間情報伝達は、最終的にFixJとDNAとの正確な結合という形で具現化される。本年度はそのメカニズムに迫るべく研究を行った。FixJのC末端側(FixJC)はDNA結合ドメインを構成しており、その立体構造をNMRを用いて解明した。この構造をもとに、DNA存在下でのNMR測定、蛍光偏光度測定などを行い、FixJのDNA結合に寄与するアミノ酸残基を特定し、結合メカニズムを明らかにすべく研究を進めた。DNA存在下、非存在下で^<15>NラベルされたFixJCの2次元^1H-^<15>NHSQCスペクトル測定を行い、アミドプロトンのクロスピークがシフトしたアミノ酸残基の同定を試みた結果、Ser44のシグナルに明らかな変化が認められた。次に蛍光物質(FITC)ラベルされたDNAとFixJの変異体を用いて蛍光偏光度測定を行った。Ser44の変異体は蛍光偏光度測定ではDNAとの結合に対する影響が見られなかったので、これが位置している4番目のαヘリックス(α4)上に存在する電荷を持つアミノ酸残基(Arg、Glu)に着目して変異体を調製した。その結果、DNAとの結合に関与しているという結果が得られた。Ser44は、DNA結合に関与するArg46と水素結合しているため、構造変化の際に影響を受け、NMR測定におけるクロスピークの変化をもたらしたと結論した。

FixL/J 是根瘤菌中含有的一种蛋白质，参与调节固氮反应。固氮反应仅在低氧浓度下发生。这是因为，当氧传感器蛋白FixL感知到氧气浓度降低时，调节蛋白FixJ被磷酸化并与固氮相关基因fixK和nifA的启动子区域结合。该FixL/J是被称为“双成分系统”的细胞内信息转导系统的典型例子。氧传感器蛋白FixL的血红素-激酶通讯最终是在FixJ与DNA的精确结合中实现的。今年，我们进行了研究以了解其背后的机制。 FixJ (FixJC) 的 C 端侧构成 DNA 结合结构域，并使用 NMR 阐明了其三维结构。基于该结构，我们进行了DNA存在下的NMR测量、荧光偏振测量等，鉴定了有助于FixJ与DNA结合的氨基酸残基，并进行了研究以阐明结合机制。在存在和不存在DNA的情况下，对^ 15 N标记的FixJC进行二维^ 1 H-^ 15 NHSQC光谱测量，并尝试鉴定具有移动的酰胺质子交叉峰的氨基酸残基，结果是明显的变化。在 Ser44 信号中观察到。接下来，我们使用荧光物质（FITC）标记的DNA和FixJ突变体测量了荧光偏振度。通过荧光偏振测量，Ser44突变体没有表现出对与DNA结合的任何影响，因此发现Ser44突变体对与DNA（Arg、Glu）的结合没有影响，我们制备了突变体。结果表明它参与与DNA的结合。结论是 Ser44 与 Arg46 存在氢键，Arg46 参与 DNA 结合，因此在结构变化过程中受到影响，导致 NMR 测量中交叉峰的变化。