細胞はどのようにして変異型UDP-グルクロン酸転移酵素を選択的に排除するのか

细胞如何选择性消除突变的 UDP-葡萄糖醛酸基转移酶？

基本信息

批准号：
09780580
负责人：
衣斐義一
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Himeji Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

(1)ヒト肝mRNAを逆転写したものを鋳型にし、ヒトUGT1A1に特異的なプライマーを用いてcDNAを増幅した。(2)Crigler-Najjar症候群を発症する患者より得られた変異型UGT1A1の配列を元に、部位特異的変異導入法により次に示す4種の変異を導入した。重症の高ビリルビン血症を示すタイプIに属する変異Q357End(357番目のグルタミンのコドンが終始コドンに変化)、K417i(417番目のリジンのコドンに1塩基が挿入されフレームシフトが生じ11残基の関係ないアミノ酸が付加される)、およびK437End(437番目のリジンのコドンが終始コドンに変化)、また比較的軽症のタイブIIに属する変異L15R(15番目のロイシンがアルギニンに変化しシグナル配列が異常になる)。(3)これらをpUCDSRαに組み込み発現ベクターを構築し、リン酸カルシウム法によりCOS細胞に導入した。(4)正常型UGT1A1は分子量が約52,000で小胞体膜の内腔側に局在し糖鎖で修飾されており、約14時間の半減期で分解された。またビリルビンに対するグルクロン酸抱合活性を持っていた。(5)Q357End、K417i、およびK437Endはすべて小胞体内腔に局在し膜と結合していなかったが、糖鎖修飾は受けていた。これら3種の変異体の分解半減期は正常型とほぼ同じであったが、ビリルビンに対するグルクロン酸抱合活性を持っていなかった。(6)L15Rは分子量が約51,000で、約40分の半減期で速やかに分解された。さらにL15Rは局在が異常で、小胞体膜の細胞質側にゆるく結合した状態あるいは細胞質に存在する事が分かった。細胞をラクタシスチンなどで処理するとL15Rの速やかな分解が抑制されることより、L15Rは本来の小胞体に局在しないため細胞質のプロテアソームにより速やかに分解される事が分った。

(1)以人肝脏mRNA的逆转录为模板，使用人UGT1A1特异性引物扩增cDNA。 (2)根据从Crigler-Najjar综合征患者获得的突变UGT1A1序列，利用定点诱变引入以下四种突变。 I 型突变表明严重高胆红素血症，包括 Q357End（第 357 个谷氨酰胺密码子变为终止密码子）和 K417i（单个碱基插入到第 417 个赖氨酸密码子中，导致移码和 11 个残基的变化）没关系K437End（437位的赖氨酸密码子变为末端密码子）、L15R（15位的亮氨酸变为精氨酸，导致信号序列异常）属于II型，相对温和）。 (3)将其插入pUCDSRα中构建表达载体，通过磷酸钙法导入COS细胞。 (4)正常UGT1A1的分子量约为52,000，定位于内质网膜的管腔侧，被糖链修饰，被降解，半衰期约为14小时。它还具有胆红素的葡萄糖醛酸化活性。 (5)Q357End、K417i和K437End均定位于内质网腔，不与膜结合，但被糖基化。这三种突变体的降解半衰期与正常型几乎相同，但它们不具有胆红素的葡萄糖醛酸化活性。 (6)L15R的分子量约为51,000，降解迅速，半衰期约为40分钟。此外，L15R被发现异常定位，要么松散地结合到内质网膜的细胞质侧，要么存在于细胞质中。用乳胞素处理细胞抑制了 L15R 的快速降解，表明 L15R 并不定位于内质网，因此会被细胞质蛋白酶体快速降解。