非晶凍結水溶液に含まれる無固定,無染色生物試料の無支持膜電顕観察法の試験研究

无定形冷冻水溶液中未固定、未染色生物样品的无支撑膜电镜观察实验研究

• 批准号: 61890009
• 负责人: 平野 正
• 金额: $ 4.8万
• 依托单位: Jikei University School of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research
• 财政年份: 1986
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1986 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-61890009/
• 关键词: 非晶凍結水; 凍結水和標本; 無固定・無染色・無支持膜; 固体・液体窒素冷媒; 極低温高分解能観察; スラッシュ(Slush); クライオトランスフアーホルダー

本研究の目的は、非晶凍結水中の生物試料(凍結水和標本)を無固定、無染色、無支持膜で極低温高分解能電顕観察する方法の確立とそのための装置の開発である。当初の研究計画をほゞ達成することができたので、概要を報告する。1.非晶凍結水の作製条件の検討。(1)安全性と経済性から、冷媒として、液体窒素のスラッシュ(Slush)(-210℃)を用いた。(2)スラッシュの調製法:液体窒素容器(400ml)およびベルジャーの容量(2.5l)を用いた。容器は発泡スチロール製を用い、内部を水容性暗褐色のペイントで塗り、固体窒素と液体窒素の識別を容易にした。また三方コックを用い、真空下でスラッシュをつくり、常圧にもどすには窒素ガスを直接ベルジャー内に注入できる装置を考案した。(3)常圧にもどしたスラッシュの中に、水を張ったグリッドを入れて急速に凍結水和標本をつくった。この非晶凍結水でできたグリッドを、あらかじめ冷却したクライオトランスファーホルダーに移した。このとき温度変化のないように液体窒素内で移し換えのできる支持台を考案した。(4)ホルダー部分にできている霜を拭いて取って、電顕試料室に挿入した。試料温度、真空度を確認の上、直接10,000倍以上で、細菌べん毛、ファージ、ウイルスタンパク等を観察した。2.高分解能電子顕微鏡観察の条件。(1)JEM1200EX(日本電子製)を用いた。試料ホルダーは常に超低温(約-170℃)。試料室は、超高真空(30×【10^(-5)】Pa)、極低温に保った。凍結水和標本の観察には充分に整備された高分解能電子顕微鏡を使用することが重要である。このことは使用機種の選定に当っても重大な要素である。凍結水和標本の作製方法については満足すべき結果を得ている。従ってこの方法のルーチン化のための解説書(報告書)の発行を準備すると同時に、更に研究を続ける予定である。より多くの共同研究者の参加を期待している。

本研究的目的是建立一种在无定形冷冻水中对生物样品（冷冻水合标本）进行低温高分辨率电子显微镜观察的方法，无需固定、染色或支撑，并开发用于此目的的设备。由于我们能够实现大部分最初的研究计划，我们想报告一个概述。 1.非晶态冷冻水生成条件的考察。 (1)出于安全和经济考虑，采用液氮雪浆(-210℃)作为制冷剂。 (2)浆料制备方法：使用液氮容器(400ml)和钟罩容量(2.5升)。该容器由聚苯乙烯泡沫塑料制成，内部涂有水溶性深棕色油漆，以便更容易区分固氮和液氮。他们还设计了一种装置，使用三通旋塞在真空下产生泥浆，然后将氮气直接注入钟罩中以恢复正常压力。 (3)将充满水的网格放置在已恢复常压的雪泥中，以快速制作冷冻水合标本。由这种无定形冷冻水制成的网格被转移到预冷的冷冻转移支架上。这时，我们设计了一种可以在液氮中转移的支撑架，以避免温度变化。 (4) 擦去支架上形成的霜并将其插入电子显微镜样品室。检查样品温度和真空度后，我们在10,000倍或以上的放大倍数下直接观察细菌鞭毛、噬菌体、病毒蛋白等。 2.高分辨率电子显微镜观察的条件。 (1)使用JEM1200EX(日本电子株式会社制造)。样品架始终保持超低温（约-170℃）。样品室保持超高真空（30×[10^(-5)] Pa）和极低温度。使用装备精良的高分辨率电子显微镜观察冷冻水合标本非常重要。这是选择要使用的模型时的一个重要因素。关于制备冷冻水合标本的方法已获得令人满意的结果。因此，我们计划继续研究，同时准备出版手册（报告），使该方法成为常规。我们希望有更多的共同研究人员参与其中。

项目成果

H.Hirokawa et al.: J. of Electron Microscopy.

H.Hirokawa 等人：《电子显微镜学杂志》。

M.Yamaguchi et al.: J.of Electron Microscopy.

M.Yamaguchi 等人：《电子显微镜杂志》。