非晶凍結水溶液に含まれる無固定,無染色生物試料の無支持膜電顕観察法の試験研究

无定形冷冻水溶液中未固定、未染色生物样品的无支撑膜电镜观察实验研究

• 批准号: 61890009
• 负责人: 平野 正
• 金额: $ 4.8万
• 依托单位: Jikei University School of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research
• 财政年份: 1986
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1986 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-61890009/
• 关键词: 非晶凍結水; 凍結水和標本; 無固定・無染色・無支持膜; 固体・液体窒素冷媒; 極低温高分解能観察; スラッシュ(Slush); クライオトランスフアーホルダー

本研究の目的は、非晶凍結水中の生物試料(凍結水和標本)を無固定、無染色、無支持膜で極低温高分解能電顕観察する方法の確立とそのための装置の開発である。当初の研究計画をほゞ達成することができたので、概要を報告する。1.非晶凍結水の作製条件の検討。(1)安全性と経済性から、冷媒として、液体窒素のスラッシュ(Slush)(-210℃)を用いた。(2)スラッシュの調製法:液体窒素容器(400ml)およびベルジャーの容量(2.5l)を用いた。容器は発泡スチロール製を用い、内部を水容性暗褐色のペイントで塗り、固体窒素と液体窒素の識別を容易にした。また三方コックを用い、真空下でスラッシュをつくり、常圧にもどすには窒素ガスを直接ベルジャー内に注入できる装置を考案した。(3)常圧にもどしたスラッシュの中に、水を張ったグリッドを入れて急速に凍結水和標本をつくった。この非晶凍結水でできたグリッドを、あらかじめ冷却したクライオトランスファーホルダーに移した。このとき温度変化のないように液体窒素内で移し換えのできる支持台を考案した。(4)ホルダー部分にできている霜を拭いて取って、電顕試料室に挿入した。試料温度、真空度を確認の上、直接10,000倍以上で、細菌べん毛、ファージ、ウイルスタンパク等を観察した。2.高分解能電子顕微鏡観察の条件。(1)JEM1200EX(日本電子製)を用いた。試料ホルダーは常に超低温(約-170℃)。試料室は、超高真空(30×【10^(-5)】Pa)、極低温に保った。凍結水和標本の観察には充分に整備された高分解能電子顕微鏡を使用することが重要である。このことは使用機種の選定に当っても重大な要素である。凍結水和標本の作製方法については満足すべき結果を得ている。従ってこの方法のルーチン化のための解説書(報告書)の発行を準備すると同時に、更に研究を続ける予定である。より多くの共同研究者の参加を期待している。

这项研究的目的是建立一种在极低温度下无定形冷冻水中观察生物样品（冷冻水合样品）的方法，并为此目的开发一种设备。我们几乎能够完成原始研究计划，因此我们将报告概述。 1。考虑准备无定形冷冻水的条件。 （1）为了安全性和经济性，将液体氮的泥浆（-210°C）用作制冷剂。 （2）制备斜线的方法：使用液氮容器（400毫升）和铃铛罐体积（2.5 L）。该容器由聚苯乙烯泡沫塑料制成，并用含水的深棕色油漆涂层，以促进固体和液氮之间的区分。此外，设计了一种设备，即使用三向公鸡在真空下形成斜线，并恢复正常压力，可以将氮气直接注入钟罐中。 （3）将充满水的网格放在已恢复正常压力的斜线中，以迅速形成冷冻水合样品。由无定形冷冻水制成的网格转移到预冷的冷冻转移持有器上。目前，设计了一个可以在液氮中转移的支撑平台，因此温度没有变化。 （4）将支架上形成的霜擦掉并插入电子显微镜样品室。在检查样品温度和真空水平后，直接观察到10,000次或更多次，细菌鞭毛，噬菌体，病毒蛋白等。 2。使用高分辨率电子显微镜观察的条件。 （1）使用JEM1200EX（由JEOL制造）。样品持有人始终处于极低的温度（约-170°C）。将样品室保持在超高真空（30×[10^（-5）PA）和极低的温度下。重要的是使用维护良好的高分辨率电子显微镜观察冷冻水合样品。选择使用的模型时，这也是关键因素。对于制备冷冻水合样品的方法，已经获得了令人满意的结果。因此，我们将准备发布一份解释性文档（报告），以实现这种方法的常规化，并继续我们的研究。我们期待更多的合作者参加。

项目成果

H.Hirokawa et al.: J. of Electron Microscopy.

H.Hirokawa 等人：《电子显微镜学杂志》。

M.Yamaguchi et al.: J.of Electron Microscopy.

M.Yamaguchi 等人：《电子显微镜杂志》。