神経細胞へ侵入する細菌毒素を利用した病原タンパク質分解技術の開発

利用侵入神经细胞的细菌毒素开发致病蛋白降解技术

基本信息

批准号：
22K18198
负责人：
宮下慎一郎
金额：
$ 3万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

近年、研究代表者はボツリヌス神経毒素 (BoNT) を基にしたキメラ毒素 (ciBoNT) を用いることにより、アルパカ由来 VHH 抗体を神経細胞内に送達することに成功した。本研究の目的は、神経細胞において恒常的に産生される内因性病原タンパク質を標的とした分解促進技術の開発である。本年度は、抗体送達の効率化を目的として、新たに２つのciBoNTキャリアーの開発を行った。BoNTおよびciBoNTキャリアーは３つのドメインから構成される。N末端側から酵素活性ドメイン (LC)、トランスロケーションドメイン (HN)、そして受容体結合ドメイン (HC) である。プロトタイプciBoNTはX型LC-HNおよびA型HCから構成される。まず、神経細胞への結合に必須であるHCの候補を探索した。ボツリヌス菌培養上清から精製したCD型BoNTとA型BoNTをマウスへ投与すると、ほぼ同程度の投与量で筋肉麻痺を示した。この結果から、CD型BoNTのHC (HC/CD) は効果的に神経細胞に結合することが考えられた。大腸菌を用いて、HC/CDを含むciBoNTの発現を試みたが、分解産物として確認された。次に、新たなLC-HNドメインの候補探索を行った。2019年、PMP1がハマダラ蚊を標的とするBoNT-like毒素であることが報告された。PMP1のLCに点変異導入し酵素活性を不活化し、大腸菌組換え発現系によりciBoNT/PmA (LCHN/PMP1-HC/A) を発現し精製した。マウスにciBoNT/PmAを腹腔内投与すると神経麻痺症状を呈した。このことから、PMP1ドメインはciBoNTキャリアーに不適であることが考えられた。

最近，主要研究人员利用基于肉毒杆菌神经毒素（BoNT）的嵌合毒素（ciBoNT）成功地将羊驼衍生的 VHH 抗体传递到神经细胞中。这项研究的目的是开发一种技术来促进神经细胞中不断产生的内源性致病蛋白的降解。今年，我们开发了两种新型ciBoNT载体，旨在提高抗体递送效率。 BoNT 和 ciBoNT 载体由三个域组成。从 N 端开始，它们是酶活性结构域 (LC)、易位结构域 (HN) 和受体结合结构域 (HC)。 ciBoNT 原型由 X 型 LC-HN 和 A 型 HC 组成。首先，我们寻找与神经元结合所必需的 HC 候选物。当从肉毒杆菌培养上清液中纯化的CD型BoNT和A型BoNT给予小鼠时，在大致相同的剂量下，它们表现出肌肉麻痹。该结果表明CD型BoNT的HC(HC/CD)有效地与神经元结合。我们尝试使用大肠杆菌表达含有HC/CD的ciBoNT，但其被确认为降解产物。接下来，我们搜索新的 LC-HN 候选域。 2019 年，据报道，PMP1 是一种针对按蚊的类 BoNT 毒素。在PMP1的LC中引入点突变以使酶活性失活，并使用大肠杆菌重组表达系统表达并纯化ciBoNT/PmA（LCHN/PMP1-HC/A）。当给小鼠腹腔注射 ciBoNT/PmA 时，它们表现出神经麻痹症状。由此认为PMP1结构域不适合作为ciBoNT载体。

项目成果

期刊论文数量（5）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Boston Children’s Hospital/Harvard Medical School(米国)

波士顿儿童医院/哈佛医学院（美国）

DOI：
发表时间：
期刊：
影响因子：
0
作者：
通讯作者：

Characterization of Serotype CD Mosaic Botulinum Neurotoxin in Comparison with Serotype C and A.

DOI：
10.3390/toxins15020123
发表时间：
2023-02-03
期刊：
Toxins
影响因子：
4.2
作者：
Miyashita SI;Karatsu S;Fujiishi M;Huang IH;Nagashima Y;Morobishi T;Hosoya K;Hata T;Dong M;Sagane Y
通讯作者：
Sagane Y

Chimeric BoNT-based platform for the delivery of antibodies into neurons

基于嵌合 BoNT 的平台，用于将抗体递送至神经元

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
Shin-Ichiro Miyashita;Jie Zhang;Sicai Zhang;Charles B. Shoemaker;Min Dong;Shin-Ichiro Miyashita
通讯作者：
Shin-Ichiro Miyashita

ボツリヌスCD型モザイク神経毒素のマウスにおける毒素活性の解析

肉毒杆菌CD型嵌合神经毒素对小鼠的毒素活性分析