神経細胞へ侵入する細菌毒素を利用した病原タンパク質分解技術の開発

利用侵入神经细胞的细菌毒素开发致病蛋白降解技术

• 批准号: 22K18198
• 负责人: 宮下 慎一郎
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Tokyo University of Agriculture
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K18198/
• 关键词: ボツリヌス神経毒素; 凝集タンパク質; ドラッグデリバリー; DDS; VHH抗体; 細菌毒素; 運動神経変性疾患

近年、研究代表者はボツリヌス神経毒素 (BoNT) を基にしたキメラ毒素 (ciBoNT) を用いることにより、アルパカ由来 VHH 抗体を神経細胞内に送達することに成功した。本研究の目的は、神経細胞において恒常的に産生される内因性病原タンパク質を標的とした分解促進技術の開発である。本年度は、抗体送達の効率化を目的として、新たに２つのciBoNTキャリアーの開発を行った。BoNTおよびciBoNTキャリアーは３つのドメインから構成される。N末端側から酵素活性ドメイン (LC)、トランスロケーションドメイン (HN)、そして受容体結合ドメイン (HC) である。プロトタイプciBoNTはX型LC-HNおよびA型HCから構成される。まず、神経細胞への結合に必須であるHCの候補を探索した。ボツリヌス菌培養上清から精製したCD型BoNTとA型BoNTをマウスへ投与すると、ほぼ同程度の投与量で筋肉麻痺を示した。この結果から、CD型BoNTのHC (HC/CD) は効果的に神経細胞に結合することが考えられた。大腸菌を用いて、HC/CDを含むciBoNTの発現を試みたが、分解産物として確認された。次に、新たなLC-HNドメインの候補探索を行った。2019年、PMP1がハマダラ蚊を標的とするBoNT-like毒素であることが報告された。PMP1のLCに点変異導入し酵素活性を不活化し、大腸菌組換え発現系によりciBoNT/PmA (LCHN/PMP1-HC/A) を発現し精製した。マウスにciBoNT/PmAを腹腔内投与すると神経麻痺症状を呈した。このことから、PMP1ドメインはciBoNTキャリアーに不適であることが考えられた。

近年来，主要研究者通过使用基于肉毒杆菌神经毒素（BONT）的嵌合毒素（Cibont）成功将羊驼源性的VHH抗体成功地输送到神经元细胞中。这项研究的目的是开发一种技术来促进靶向靶向内源性病原体蛋白的降解，这些蛋白质是在神经元中产生的。今年，我们开发了两个新的Cibont载体，目的是提高抗体递送的效率。 BONT和CIBONT载体由三个域组成。从N端是酶的活性域（LC），易位域（HN）和受体结合域（HC）。 Cibont原型由X型LC-HN和A型HC组成。首先，我们搜索了候选者的HC，这对于与神经元结合至关重要。当CD型BONT和A型BONT从肉毒杆菌的培养上清液中纯化给小鼠的培养物上清液时，以大致相同的剂量证明了肌肉麻痹。从这些结果中可以认为，CD型BONT的HC（HC/CD）有效地与神经元结合。我们尝试使用大肠杆菌表达含有HC/CD的Cibont，但被确认为降解产物。接下来，将候选人搜索新的LC-HN域。 2019年，据报道，PMP1是靶向海葵蚊子的类似BONT的毒素。通过点诱变将酶活性灭活到PMP1的LC中，Cibont/PMA（LCHN/PMP1-HC/A）被表达并通过重组大肠杆菌表达系统纯化并纯化。小鼠接受了Cibont/PMA和神经分析症状的腹膜内给药。这表明PMP1域不适合Cibont载体。

项目成果

Boston Children’s Hospital/Harvard Medical School(米国)

波士顿儿童医院/哈佛医学院（美国）

Characterization of Serotype CD Mosaic Botulinum Neurotoxin in Comparison with Serotype C and A.

• DOI: 10.3390/toxins15020123
• 发表时间: 2023-02-03
• 期刊: Toxins
• 影响因子: 4.2
• 作者: Miyashita SI;Karatsu S;Fujiishi M;Huang IH;Nagashima Y;Morobishi T;Hosoya K;Hata T;Dong M;Sagane Y
• 通讯作者: Sagane Y

Chimeric BoNT-based platform for the delivery of antibodies into neurons

基于嵌合 BoNT 的平台，用于将抗体递送至神经元

• 发表时间: 2022
• 作者: Shin-Ichiro Miyashita;Jie Zhang;Sicai Zhang;Charles B. Shoemaker;Min Dong;Shin-Ichiro Miyashita
• 通讯作者: Shin-Ichiro Miyashita

ボツリヌスCD型モザイク神経毒素のマウスにおける毒素活性の解析

肉毒杆菌CD型嵌合神经毒素对小鼠的毒素活性分析

• 发表时间: 2023
• 作者: 宮下慎一郎;藤石眞子;唐津修羅;諸菱環;長嶋有希;畑剛士;黄インシュン;細谷圭太;相根義昌
• 通讯作者: 相根義昌

Post-exposure treatment for botulism by delivery of antibodies using a chimeric toxin-based platform

通过使用基于嵌合毒素的平台递送抗体来治疗肉毒杆菌中毒

• 发表时间: 2022
• 作者: Shin-Ichiro Miyashita;Jie Zhang;Sicai Zhang;Charles B. Shoemaker;Min Dong
• 通讯作者: Min Dong