多能性を維持したVitrification歯根膜幹細胞スフェロイド確立の試み

尝试建立保持​​多能性的玻璃化牙周膜干细胞球体

• 批准号: 22K17096
• 负责人: 佐野 孝太朗
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Kyushu Dental College
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K17096/
• 关键词: 歯周病; 再生医療; スフェロイド; 歯根膜幹細胞; Vitrification; 凍結保存; 歯周組織再生

歯根膜幹細胞を3次元的に培養した歯根膜幹細胞スフェロイドは、これまでの研究により、一般的な単層培養細胞と比較して生理的機能が向上しており、歯周組織再生に有効であることが報告されている。ところが、スフェロイド作製に十分な細胞数を確保するまで歯根膜幹細胞を培養・継代する必要があること、スフェロイド作製用マイクロウェルチップに細胞を播種する前にチップに表面処理等の準備をする必要があること、チップに播種した後も歯根膜幹細胞が凝集しスフェロイドを形成するまで培養を続けること、等の理由で、歯根膜幹細胞スフェロイドを入手するまでにある程度の時間を要する。このことは歯根膜幹細胞スフェロイドの今後の臨床応用に向けての実用性・工程の簡便性を考慮すると、障害になる可能性があった。そこで、歯根膜幹細胞スフェロイドをガラス化法（Vitrification）により凍結し、多分化能および組織再生能を維持したまま長期保存することで、必要な際に即時入手可能となる環境構築を試みた。今年度は歯根膜幹細胞スフェロイドを2種類の凍結法；ガラス化法および緩慢凍結法（Slow freezing）により凍結・一定期間保存後した後に解凍し、凍結前後で形態および多分化能に変化するか検討を行った。歯根膜幹細胞スフェロイドを凍結し、7日（短期）・30日（中期）の保存後解凍した。形態は球状を維持していた。リアルタイムPCR法にて幹細胞性の指標となるOCT4、NANOGの発現を確認したところ、凍結前と概ね変化は見られなかった。Live/Dead染色より、生存率についてはガラス化法が緩慢凍結法に比べて優れていることが明らかになった。現在、より長期（90日）の保存条件での検討を行っている。

此前的研究表明，三维培养的牙周膜干细胞——牙周膜干细胞球体，与一般单层培养的细胞相比，具有改善的生理功能，对牙周组织再生有效。然而，需要对牙周膜干细胞进行培养和传代培养，直到获得足够数量的用于球状体制作的细胞，并且在将细胞接种到微孔芯片中用于球状体制作之前，需要对芯片进行表面处理等准备工作。由于多种原因，获得牙周膜干细胞球体需要一定的时间，包括即使在接种到芯片上后也需要继续培养牙周膜干细胞直到它们聚集并形成球体。在考虑牙周膜干细胞球体未来临床应用过程的实用性和简单性时，这可能会成为一个障碍。因此，我们试图创造一个环境，在需要时可以立即获得牙周膜干细胞球体，通过玻璃化冷冻并长期保存它们，同时保持其多能性和组织再生能力。今年，我们将采用玻璃化和慢速冷冻两种冷冻方法冷冻牙周膜干细胞球体，保存一定时间，然后解冻，并检查冷冻前后其形态和多能性是否发生变化。做到了。牙周膜干细胞球体储存7天（短期）和30天（中期）后冷冻并解冻。形状保持球形。当我们使用实时PCR确认OCT4和NANOG（干性指标）的表达时，我们发现与冷冻前相比没有变化。活/死染色显示，玻璃化法在存活率方面优于慢速冷冻法。我们目前正在研究长期储存条件（90 天）。