Elucidation of the mechanism by which exosomes released from bone-derived human bone tissue-derived mesenchymal stromal cells lead to bone formation

阐明骨源性人骨组织源性间充质基质细胞释放的外泌体导致骨形成的机制

• 批准号: 22K16990
• 负责人: 杉本 佳香
• 金额: $ 2.83万
• 依托单位: Kitasato University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K16990/
• 关键词: エクソソーム; 骨組織由来間葉系細胞; 唇顎口蓋裂; 骨組織再生; 長期凍結保存

エクソソームの効率的かつ短時間で、簡便な精製方法を確立すべく、新たに2種類の方法を施行し比較した。培養上清はコントロールとして誘導（－）群と、骨誘導群を作成し、day 0,4,7,9,14,18,21の計7回採取し、エクソソームを精製した。細胞や細胞残渣が含まれないように、培養上清を一度1500rpm(300g程度)にて5分程度遠心し上清を回収し、0.22μmフィルターを通してから使用した。1つ目の方法はアミコンウルトラ15（メルク社）を用いて、スイングバケットローターを使用し4000gで約15-60分間回転させ、total量500μlとなるように調整した。培養上清20mlから500μｌ　1本精製された換算となり、これらのエクソソーム（Exo.）は、-80℃で保管した。2つ目の方法はDojindoのExolsolator　Exosome　Isolation　Kitを用いて行った。こちらも最終total量は500μlとなるように調整した。こちらも同様に―80℃で保管した。エクソソーム採取最終日（分化誘導後21日）に、エクソソーム採取後に骨誘導なし群と骨誘導群のフラスコをAlizarin Redで染色し、骨分化誘導群で骨（カルシウム）が形成されていることを確認した。更に保存したエクソソームの一部を用いて、定量キットFluoroCet（Funakoshi）の蛍光法で概算量を確認した。今後はウエスタンブロッティングで定性確認予定であり、また以前他の3種の方法でエクソソームの精製比較をしているため、どの方法が良いかを確立し、in vivo の実験に移行予定である。

为了建立一种高效、快速、简单的外泌体纯化方法，我们实施并比较了两种新方法。在第0、4、7、9、14、18和21天从诱导(-)组和作为对照的骨诱导组总共收集7次培养上清液，并纯化外泌体。为了避免含有细胞或细胞碎片，将培养上清液以1500rpm(约300g)离心一次约5分钟，收集上清液，使用前将上清液过0.22μm过滤器。第一种方法是使用 Amicon Ultra 15 (Merck & Co.) 并使用吊桶式转子在 4000g 下旋转约 15-60 分钟，将总体积调节至 500μl。这对应于从 20 ml 培养物上清液中纯化的一瓶 500 μl 的外泌体 (Exo.)，并且这些外泌体 (Exo.) 储存在 -80°C。第二种方法是使用 Dojindo 的 Exolsolator 外泌体分离试剂盒完成的。最终总体积也调整为500μl。这也储存在-80°C。收集外泌体的最后一天（分化诱导后21天），收集外泌体后，将非骨诱导组和骨诱导组的烧瓶用茜素红染色，确认骨（钙）形成。成骨分化组。另外，使用保存的外泌体的一部分，使用定量试剂盒FluoroCet(Funakoshi)，通过荧光法确认大致量。将来，我们计划使用蛋白质印迹进行定性确认，并且由于我们之前使用其他三种方法比较了外泌体纯化，因此我们计划确定哪种方法更好并继续进行体内实验。