CRISPR-Cas9スクリーニングによる卵巣奇形腫悪性転化の新規治療の開発

利用 CRISPR-Cas9 筛选开发卵巢畸胎瘤恶性转化的新疗法

基本信息

批准号：
22K16831
负责人：
玉内学志
金额：
$ 3万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K16831/
关键词：
卵巣癌 CRISPR-Cas9 ノックアウトスクリーニング患者腫瘍由来モデル

项目摘要

【ノックアウトスクリーニングの進捗状況】当研究室で樹立した卵巣奇形腫悪性転化の細胞株NOSCC1を用いて、CRISPR-Cas9ノックアウトスクリーニングを実施した。NOSCC1に対してCas9タンパクを導入後、sgRNAライブラリを発現するレンチウィルスをインフェクションさせた多様な遺伝子プロファイルを持つ細胞集団を作成し、スクリーニングの選択圧としてシスプラチン添加を行った。セレクション完了後にgDNAを抽出し、生存細胞に取り込まれたsgRNA配列のアンプリコンシーケンスを行い、リファレンス細胞との比較を行った。ネガティブスクリーニングの結果、25個の遺伝子が見出された。創薬可能性の観点から絞り込みを行い、10個の遺伝子が新規治療標的遺伝子として見出された。10個の遺伝子について、細胞株を用いたノックダウン実験を行い、さらに4種類の遺伝子へと選別を行った。【薬効試験の準備状況】当研究室では卵巣奇形腫悪性転化の患者腫瘍由来モデル (PDX) も樹立しており、PDXマウス腫瘍を分割して多数のヌードマウスに再移植することで、多数の擬似的な担癌患者集団を作成することが可能であり、これらのマウスへの投薬によってヒトの腫瘍に対する抗腫瘍効を検証できる。新たに1種のPDXが樹立され、腫瘍増大の自然史を含めた予備的データ取得を完了しており、新規標的遺伝子に対する阻害剤投与試験のフェーズを速やかに実行する体制が構築されつつある。

【敲除筛选进展】利用本实验室建立的卵巢畸胎瘤恶变细胞系NOSCC1进行CRISPR-Cas9敲除筛选。将Cas9蛋白引入NOSCC1后，我们通过用表达sgRNA文库的慢病毒感染细胞群来创建具有不同遗传特征的细胞群，并添加顺铂作为筛选的选择压力。选择完成后，提取gDNA，对纳入活细胞的sgRNA序列进行扩增子测序，并与参考细胞进行比较。阴性筛选的结果是，发现了 25 个基因。从药物发现潜力的角度缩小基因范围后，发现了 10 个基因作为新的治疗靶基因。使用细胞系对10个基因进行敲低实验，将基因进一步分为四种类型。【药效测试准备情况】我们实验室还建立了卵巢畸胎瘤恶变的患者肿瘤衍生模型（PDX），可以创建一个伪癌症患者群体，并通过对这些患者进行药物治疗。小鼠实验中，对人类肿瘤的抗肿瘤作用得到了验证。一种新型PDX已建立，包括肿瘤生长自然史在内的初步数据已获得，正在建立系统以迅速实施新靶基因的抑制剂给药试验阶段。