In vitro cerebral infarction model using assembloid culture system

使用Assembloid培养系统建立体外脑梗死模型

• 批准号: 22K16685
• 负责人: 馬塲 庸平
• 金额: $ 2.83万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K16685/
• 关键词: iPS細胞; 虚血耐性; 脳梗塞; 大脳オルガノイド

初年度は大脳オルガノイド及び内側神経節隆起オルガノイドの誘導を行い、誘導方法としては安定して作出できるようになった。両者の分化については、定量的RT-PCRでのマーカー遺伝子の発現で確認されている。現在、iPS細胞標準株３ラインでの誘導の大脳オルガノイドの検討をおこない、分化指向性もしくは継代状態による影響で効率的な分化は２ラインにとどまっている。このため今後のRNAseqでの検討に際して、検討に必要なライン数を確保できていないため、大脳オルガノイドに効率よく分化しうる他のiPS細胞標準株もしくは、維持状態の良好なiPS細胞標準株の確保が必須であると考えられた。並行して低酸素培養キットを用いた試験管内虚血負荷モデルの検討を進めている。同キットを使用した場合に、培養条件下の大脳オルガノイドに対して虚血負荷に類似した細胞毒性の出現を確認できるかをまずに確認予定であるが、すでにキットの導入を終え、実際に培養に用いるiPS細胞の拡大培養及び大脳オルガノイドの調整準備を進めている。準備出来次第、まずは１－６時間の負荷で細胞毒性が確認しうるかを免疫染色法で評価し、虚血負荷の条件の設定を考えている。実験系を確立するにあたり、低酸素培養に用いる培地の扱いや調製についてのプロトコルの作成を具体的に進めている。特に、調製の際に培地内に酸素が多く持ち込まれると、溶存酸素(DO)が数時間の低酸素培養の間に想定される平衡状態に達しない可能性が考えられ、その影響を十分に考慮する必要性が判明し、この点に関しての手技上の工夫や評価系の追加を検討している。

第一年，诱导大脑类器官和内侧神经节隆起类器官，诱导方法趋于稳定。使用定量 RT-PCR 通过标记基因表达证实了两者之间的差异。目前，我们正在研究使用三种标准 iPS 细胞系诱导脑类器官，但由于分化倾向或传代状态的影响，有效分化仅限于两种细胞系。因此，我们无法确保未来 RNAseq 研究所需的细胞系数量，因此我们正在确保其他能够有效分化为脑类器官的 iPS 细胞标准系，或者维护良好的 iPS 细胞标准系。 。与此同时，我们正在研究使用缺氧培养试剂盒的体外缺血应激模型。使用该试剂盒时，我们计划首先确认是否可以在培养条件下确认脑类器官出现类似于缺血负荷的细胞毒性，但我们已经引入了该试剂盒，目前正在准备进行实际培养。扩增 iPS 细胞并制备用于此目的的脑类器官。准备工作完成后，我们将首先使用免疫染色评估是否可以通过1-6小时负荷确认细胞毒性，然后考虑设置缺血负荷条件。在建立实验系统时，我们目前正在努力创建处理和准备用于低氧培养的培养基的方案。特别是，如果在制备过程中向培养基中引入大量氧气，则在低氧培养的几个小时内溶解氧（DO）可能无法达到预期的平衡状态，这一点已明确需要考虑在内，我们正在考虑改进技术并增加这方面的评估系统。