Mycobacterium abscessusのヒト気道上皮細胞感染機構の解明

脓肿分枝杆菌感染人气道上皮细胞机制的阐明

• 批准号: 22K16385
• 负责人: 鎌田 啓佑
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: 公益財団法人結核予防会 結核研究所
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K16385/
• 关键词: M. abscesses; 気道上皮細胞; 好中球エラスターゼ; 接着; 非結核性抗酸菌; Mycobacterium abscessus

ヒト気道上皮初代細胞を4系統(健常人: 近位気道、遠位気道, COPD患者: 近位気道、遠位気道)用意し、気相液相界面(air liquid interface: ALI)培養による気道上皮モデル構築を行なった。培養液としてPneumacult ALI(STEMCELL), 遠位気道モデル構築はPneumacult ALI-S(STEMCELL)をそれぞれ使用した。健常人近位気道および、COPD患者遠位気道上皮細胞の2系統については適切な細胞増殖および分化が確認された。しかし残りの2系統(健常人：遠位気道, COPD患者：近位気道)に関しては細胞増殖の速度が遅く、培養条件や培地を検討したが適切な分化は確認できなかった。感染実験に用いるためのM. abscessus. subsp abscessus のtype strain (ATCC19977)に対して形質転換を行いGFP発現プラスミドを導入した。ここまで実験を行なった段階でALI培養を行う上で必要となる培養インサートが品薄となり入手困難となってしまったため上記初代細胞を用いたALI培養は中断せざるを得なかった。代替手段としてiPS由来気道上皮細胞モデル(HiLung)を用いて感染実験を行なった。培養インサート頂端側を好中球エラスターゼ100μl (濃度10μg/ml, 50μg/ml)で8時間処理したのちにM. abscessus subsp abscessus のType strainおよび臨床分離株から調製した菌液を頂端側に感染させ6時間後に十分洗浄し接着菌数を計測した。いずれの菌株においてもコントロール(PBS)と比較し好中球エラスターゼ処理群では接着菌数が多く、好中球エラスターゼ10mμg/mlと50μg/mlの比較では50μg/mlの方が接着菌数が多い傾向が示された。Type strainに関しては免疫染色で接着細菌の分布を観察したところ非繊毛上皮細胞に接着する傾向が観察されたが気道上皮細胞へ直接侵入する菌体は観察できなかった。

制备了四个主要的人气道上皮细胞（健康的人：近端气道，远端气道，COPD患者：近端气道，远端气道），使用空气液体界面（ALI）培养物构建了气道上皮模型。气动ALI（Stemcell）用作培养基，使用气pneumault Ali-S（Stemcell）来构建远端气道模型。证实了健康个体的近端气道和COPD患者远端气道上皮细胞的两条线的适当细胞增殖和分化。但是，其余两种菌株（健康个体：远端气道和COPD患者：近端气道）的细胞增殖率较慢，尽管检查了培养条件和培养基，但无法确认适当的分化。脓肿分枝杆菌的类型菌株。用于在感染实验中使用的亚种必太华（ATCC19977）进行了转化，以引入GFP表达质粒。在直到现在进行实验的阶段，ALI培养所需的培养插入物是短缺且难以获得的，因此使用上述原代细胞难以获得ALI培养。另一种选择是使用IPS衍生的气道上皮细胞模型（Hilung）进行感染实验。用100μl中性粒细胞弹性酶（浓度为10μg/ml，50μg/ml）处理培养物插入片的顶端，持续8小时，然后用细菌溶液感染了来自脓肿菌的类型菌株的细菌溶液，并在6小时后，临床隔离株和临床隔离株和6小时后，均为Adherents neveria，是Adherrents的数量。在所有菌株中，与对照组（PBS）相比，中性粒细胞弹性酶治疗组中的粘附细菌数量，与中性粒细胞弹性酶相比，与10mμg/ml和50μg/ml的中性粒细胞弹性酶相比，中性粒细胞弹性酶倾向于在50μg/mL中具有较高的粘附细菌。关于类型菌株，当我们通过免疫染色观察到粘附细菌的分布时，我们观察到粘附在非西皮细胞上的趋势，但是我们无法观察到直接入侵气道上皮细胞的细胞。