関節リウマチとシトルリン化蛋白質の関係にリボソームの異常から迫る

通过核糖体异常探讨类风湿性关节炎与瓜氨酸蛋白之间的关系

• 批准号: 22K16346
• 负责人: 福井 翔一
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: Nagasaki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K16346/
• 关键词: 関節リウマチ; リボソーム; シトルリン化蛋白; 蛋白質シトルリン化; 炎症性サイトカイン; PAD4

当初の計画に従い患者検体を収集し、まずは血清中の炎症性サイトカインがリボソームでの蛋白翻訳に影響を与える可能性を考え、患者血清を健常人好中球に添加し、OPPを用いた蛋白翻訳アッセイを行った。しかし、疾患活動性の高い治療前血清と疾患活動性の低い治療後検体の間に差を見出すことはできなかっただけでなく、アッセイを繰り返すと、検体間のばらつきが大きく、一貫した結果を得ることが非常に難しいことが明らかとなった。マウスの検体を用いて各種遺伝子のノックアウトとの差のような比較的大きな差を検出する場合にはOPPを用いた蛋白翻訳アッセイは有用であるものの、ヒトの検体のように差異が比較的小さい場合には、評価が難しいものと考えられた。このため、当初予定していた患者の血球を用いてのOPPによる蛋白翻訳アッセイは行わないこととした。続いて、患者検体でのばらつきを克服するため、関節リウマチ患者の滑膜細胞を用いることとした。細胞株は患者検体と形質に大きく違いが生じ、増殖能の差異はとくに翻訳過程を評価する上では好ましくないと考えられたため患者滑膜細胞を選択した。まずは本研究を構想する契機となったマウスでのPadi4ノックアウトによるサイトカイン産生の低下や翻訳過程の差異をヒトでも確認することとした。PADI4をノックダウンするためにsiRNAを用い、コントロールとPADI4のいずれのsiRNAも滑膜細胞の増殖能に影響を与えなかった。続いて、siRNAによりPADI4を抑制し、サイトカイン産生をさせるためにリポポリサッカライドで刺激を行った。予想に反して、サイトカイン産生はコントロールと比較しPADI4ノックダウンで上昇していた。マウスとヒト、ノックアウトとノックダウン、用いた細胞も異なるものの、相反する結果となったため、シトルリン化の蛋白翻訳への影響についての仮説の再検討が必要な状態である。

我们按照原计划采集了患者样本，首先考虑到血清中的炎症细胞因子影响核糖体中蛋白质翻译的可能性，我们将患者血清添加到健康的中性粒细胞中，并使用OPP进行蛋白质翻译测定。然而，我们不仅无法发现疾病活动度高的治疗前血清和疾病活动度低的治疗后样本之间的差异，而且重复检测显示样本间的高变异性和不一致的结果。是很难获得的。当使用小鼠样本检测相对较大的差异（例如各种基因敲除之间的差异）时，使用 OPP 的蛋白质翻译测定非常有用，但当差异相对较小时（例如使用人类样本时），评估被认为很困难。因此，我们决定不按原计划使用患者的血细胞进行 OPP 蛋白质翻译测定。接下来，为了克服患者样本的变异性，他们决定使用来自类风湿关节炎患者的滑膜细胞。选择患者的滑膜细胞是因为细胞系与患者标本的特征差异很大，并且增殖能力的差异被认为是不利的，特别是在评估翻译过程时。首先，我们决定在人类中确认 Padi4 基因敲除在小鼠中引起的细胞因子产生的减少和翻译过程的差异，这是本研究的动力。我们使用siRNA敲低PADI4，对照和PADI4 siRNA均不影响滑膜细胞的增殖能力。接下来，用 siRNA 抑制 PADI4，并用脂多糖刺激 PADI4 以诱导细胞因子的产生。与预期相反，与对照组相比，PADI4 敲低中细胞因子的产生有所增加。尽管小鼠和人类、敲除和敲低以及使用的细胞不同，但得到了矛盾的结果，因此有必要重新审视关于瓜氨酸化对蛋白质翻译的影响的假设。