ヒトiPS細胞由来腎臓オルガノイドを用いたLMX1B変異に伴う腎症の病態解明

使用人 iPS 细胞衍生的肾类器官阐明与 LMX1B 突变相关的肾病病理学

基本信息

批准号：
22K16246
负责人：
田中悦子
金额：
$ 2.91万
依托单位：
University of Miyazaki
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K16246/
关键词：
LMX1B 腎臓オルガノイド iPS細胞ヒトポドサイト

项目摘要

LMX1B遺伝子は、腎臓で血液から尿を濾過するろ過装置である糸球体の発生や、糸球体の中で濾過膜を形成する上皮細胞とスリット膜の形態および機能維持に関与することが知られている。そして、LMX1B遺伝子異常は蛋白尿および腎機能障害を来すLMX1B遺伝子関連腎症の原因であることがわかっているが、その病態は明らかになっていない。マウスのモデルではヒトの病態を再現できておらず、ヒト特有の病態モデル作製が期待されている。近年、ヒトiPS細胞から腎臓オルガノイドの分化誘導法が確立され(Cell Stem Cell, 2014;2;14:53-67)、ヒト細胞由来の糸球体上皮細胞およびスリット膜の構造をin vitroで再現できるようになった。そこで我々は、LMX1B変異を導入したヒトiPS細胞から腎臓オルガノイドを誘導し、ヒトLMX1B関連腎症の病態モデルを作製と病態解析を試みている。まず、健常者由来ヒトiPS細胞のLMX1B遺伝子にCRISPR/Cas9システムを用いて、ゲノム編集を行った。iPS細胞の培養とgRNAのデザインを行い、エレクトロポレーション法でゲノム編集した。エレクトロポレーション後のバルク細胞集団から抽出したゲノムDNAのPCRおよび制限酵素切断、シークエンス解析を行い、ゲノム編集が成功したことを確認した。限界希釈法によるサブクローニングを行い、ノックアウト株と正常株をそれぞれ3つずつ樹立できた。しかし、ヘテロ変異株が得られず、再度、同様の方法でゲノム編集を行った。２回目のエレクトロポレーション後のバルク細胞に変異導入が成功した細胞が含まれていることが確認できており、サブクローニングを開始する。今後、樹立した株ごとに腎臓オルガノイドへの分化能を確認し、LMX1B腎症の病態モデルとして解析を行う予定である。

已知 LMX1B 基因参与肾小球（肾小球是从肾脏血液中过滤尿液的过滤装置）的发育，并参与维持形成滤过膜的上皮细胞和裂隙膜的形态和功能。肾小球有。尽管已知LMX1B基因异常是LMX1B基因相关肾病的病因，导致蛋白尿和肾功能障碍，但发病机制尚不清楚。小鼠模型尚未能够重现人类病理学，但有希望创建人类特异性病理学模型。最近，建立了一种诱导人iPS细胞分化为肾类器官的方法(Cell Stem Cell, 2014;2;14:53-67)，可以再现人细胞来源的肾小球上皮细胞和裂隙膜的结构体外就变成这样了。因此，我们试图通过从含有 LMX1B 突变的人 iPS 细胞诱导肾类器官来创建和分析人 LMX1B 相关肾病的病理模型。首先，使用 CRISPR/Cas9 系统对源自健康个体的人类 iPS 细胞的 LMX1B 基因进行基因组编辑。我们培养 iPS 细胞，设计 gRNA，并使用电穿孔编辑基因组。电穿孔后从大量细胞群中提取的基因组 DNA 进行 PCR、限制性酶消化和序列分析，以确认基因组编辑成功。通过使用有限稀释法进行亚克隆，我们能够建立三个敲除菌株和三个正常菌株。但由于无法获得杂合突变株，因此用同样的方法再次进行基因组编辑。已确认第二次电穿孔后的原液细胞中含有已成功导入突变的细胞，并开始亚克隆。未来，我们计划确认每个已建立的菌株分化为肾类器官的能力，并将其作为LMX1B肾病的病理模型进行分析。