膜トポロジー変化に着目した核膜病の分子機序解明と心臓・筋疾患の治療標的分子探索

阐明核膜疾病的分子机制，重点关注膜拓扑结构的变化，寻找心脏和肌肉疾病的治疗靶分子

• 批准号: 22K16103
• 负责人: 四宮 春輝
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K16103/
• 关键词: 核膜病; 不整脈原性心筋症; 膜トポロジー; 筋ジストロフィー

遺伝性心筋症患者と同一の遺伝子変化を導入した疾患モデル動物TMEM43-S358Lノックインラットを用いた生化学的解析によりこれまで明らかにしていたTMEM43変異蛋白の糖鎖修飾変化や小胞体から核膜への局在変化が、患者から樹立したヒトiPS心筋細胞においても同様に認められるかを検証した。通常状態では、健常者由来と患者由来のiPS心筋細胞で分子修飾や局在に明らかな変化は見られなかったが、細胞に小胞体ストレスをかけることで患者由来の細胞においてのみ、糖鎖修飾変化や小胞体から核膜への局在変化が見られることを明らかにした。また、PAタグを付加したTMEM43の野生型と変異型のアデノウイルスベクターを新生児心筋細胞に発現させ、相互作用蛋白の同定を試みた。相互作用蛋白の結合の特異性を上げるために細胞内分画を行なった上で検証を行なったところ、野生型のTMEM43蛋白には結合するにも関わらず、変異型のTMEM43蛋白には結合しない小胞体膜蛋白を同定した。さらに、核膜に蓄積した変異型TMEM43蛋白が核内の遺伝子発現に及ぼす影響を明らかにするために、まだ明らかな心臓線維化の表現型が出ていない6ヶ月齢のラットを用いて、心臓の外層と内層からそれぞれ心筋組織を採取し解析を行なった。TMEM43-S358Lノックインラットの心筋では、野生型ラットと比較して心臓の内層外層間のイオンチャネルやトランスポーターに関連する遺伝子群の発現差が減少しており、これらの遺伝子発現差の減少がノックインラットの催不整脈性に関与している可能性が示唆された。

使用TMEM43-S358L敲入大鼠（一种疾病模型动物，其中引入了与遗传性心肌病患者相同的基因变化）进行生化分析，揭示了TMEM43突变蛋白糖基化的变化及其从内质网到细胞核的转移我们验证了在从患者建立的人类 iPS 心肌细胞中是否观察到相同的定位变化。在正常情况下，来自健康受试者和患者的iPS心肌细胞中没有观察到明显的分子修饰或定位变化，但通过对细胞施加内质网应激，仅在来自患者的细胞中观察到聚糖修饰。是从内质网到核膜的定位变化。我们还在新生儿心肌细胞中表达了 PA 标记的野生型和突变型 TMEM43 腺病毒载体，并尝试鉴定相互作用蛋白。为了增加相互作用蛋白的结合特异性，我们进行了亚细胞分级分离，并验证了虽然它与野生型TMEM43蛋白结合，但它不与突变型TMEM43蛋白结合，我们鉴定了内质网膜蛋白。此外，为了阐明核膜中积累的突变TMEM43蛋白对细胞核内基因表达的影响，我们利用尚未出现明显心脏纤维化表型的6个月大的大鼠进行了研究，收集了心肌组织。从身体的外层和内层进行分析。在TMEM43-S358L敲入大鼠的心肌中，与野生型大鼠相比，心脏内外层之间与离子通道和转运蛋白相关的基因表达差异减少，并且这些基因表达差异的减少有人认为它可能与大鼠的致心律失常有关。

项目成果

膜トポロジー変化を伴う核膜蛋白 TMEM43 S358L による心筋症の新規病態機序

核膜蛋白TMEM43 S358L伴膜拓扑变化引起心肌病的新病理机制

• 发表时间: 2022
• 作者: 呉家賢;井上剛;四宮春輝
• 通讯作者: 四宮春輝