小児急性リンパ性白血病におけるNUDT遺伝子多型のディプロタイプ解析方法の確立

儿童急性淋巴细胞白血病NUDT基因多态性双倍型分析方法的建立

• 批准号: 22K15944
• 负责人: 市村 卓也
• 金额: $ 2.25万
• 依托单位: Yamaguchi University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K15944/
• 关键词: 急性リンパ性白血病; 6-メルカプトプリン; NUDT15; 遺伝子多型; デジタルPCR

本研究では、2010年1月以降に山口大学医学附属病院小児科で急性リンパ性白血病と診断し、維持療法で6-メルカプトプリンを投与した症例を対象とした。方法としては、患者末梢血中に含まれる正常白血球からキットを用いてDNAを抽出した。次に、キットを用いてPCRを行い、NUDT15 エクソン1およびエクソン 3領域を増幅した。続いて、増幅したPCR産物の塩基配列をダイレクトシーケンス法によりNUDT15多型の有無について解析した。ダイレクトシーケンスの結果、対象のうち21例が解析でき、16例がNUDT15多型なし、5例が多型ありであった。多型ありの内、3例がc.415C>Tのヘテロ接合性多型、1例がc.52G>Aとc.415C>Tの2つのヘテロ接合性多型、残りの1例がc.415C>Tのホモ接合性多型とc.36_37insGGAGTCのヘテロ接合性多型を有していた。2つのヘテロ接合性多型を持つ症例について、ディプロタイプ解析のためクローニングを用いた解析を行った。まず、正常白血球から抽出したmRNAを用いて相補的DNA（cDNA）を合成した。合成したcDNAをキットを用いてクローニングし、合計9個のコロニーが得られた。ダイレクトシーケンスを用いて解析を行った結果、2種類の多型はそれぞれ別のアレルに存在することが分かり、複合ヘテロ接合性多型であるとわかった。また、同症例をデジタルPCRを用いてディプロタイプ解析を行った。まず多型を有するアレルが標識されるようなプローブを設計し解析した結果、c.52G>Aの多型を有する集団とc.415C>Tの多型を有する集団とに分かれ、デジタルPCRで複合ヘテロ接合性多型であることが確認できた。

这项研究包括在2010年1月以后Yamaguchi University医学分支机构医院诊断出急性淋巴细胞性白血病的病例，并被服用6-巯基嘌呤作为维持疗法。作为一种方法，使用试剂盒从患者外周血中包含的正常白细胞中提取DNA。然后使用套件进行PCR，以扩增NUDT15外显子1和外显子3区域。随后，通过直接测序分析了扩增的PCR产物的碱基序列，以存在或不存在NUDT15多态性。直接序列导致了21例受试者，有16例没有NUDT15多态性的病例和5例具有多态性的病例。在多态性中，有3个具有杂合的多态性为c.415c> t，1个具有两个杂合的多态性c.52g> a和c.415c> t，其余的则具有c.415c> t和c.415c> t和c.36的纯合多态性。使用克隆进行外交型分析分析了两个杂合多态性的病例。首先，使用从正常白细胞中提取的mRNA合成互补的DNA（cDNA）。使用试剂盒克隆合成的cDNA，以获得总共9个菌落。使用直接序列的分析表明，两种类型的多态性存在于不同的等位基因中，并且它们是复合的杂合多态性。此外，该案件还使用数字PCR进行了外交型分析。首先，我们设计并分析了一个探针，其中标记了具有多态性的等位基因，并将其分为具有C.52G> A多态性和具有C.415c> t多态性的人群，并被数字PCR证实，它是一种复合的杂合杂合多态性。