発達段階の神経細胞内でGNAO1遺伝子が関わる機能的極性調節機構の解析

GNAO1基因在发育神经元中的功能极性调节机制分析

• 批准号: 22K15913
• 负责人: 赤峰 哲
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: Fukuoka Children’s Hospital
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K15913/
• 关键词: GNAO1遺伝子; 発達性てんかん性脳症; 成長円錐; カルシウム依存性シグナル; 機能的極性

本研究では発達性てんかん性脳症（DEE）関連遺伝子GNAO1とSPTAN1に着目してこれらの遺伝子の下流に存在する分子シグナルが発達段階における神経細胞の成長円錐をどのように調節しているかを解析する。特にGNAO1の下流に存在するカルシウム依存性シグナルが与える成長円錐への影響を解析することで、GNAO1が神経細胞の機能的極性をどの様に調節しているかを明らかにし最終的に新しい治療標的を見出すことを目的とする。2022年度に我々はGnao1をSiRNAでノックダウンしたNeuro-2a細胞を用いて蛍光免疫抗体法を行い、Gnao1タンパク質（Gαo）やその他の細胞骨格タンパク質の神経突起や成長円錐における発現プロファイルを共焦点レーザー顕微鏡で解析した。次にヒトiPS細胞から樹立したオルガノイドを用いて、脳オルガノイド内もしくは脳オルガノイドから分離した単層ニューロンの成長円錐におけるGαoや細胞骨格タンパク質の発現を正常コントロール、GNAO1ノックアウト、患児由来（G203R）で比較・検証した。また神経細胞を用いたRNA-seq解析によりGNAO1の下流に存在する分子シグナルを検索した。今後、GNAO1が関連する分子シグナルを同定するために生化学実験で確認を行い、さらに特異的な阻害薬または核酸誘導体を用いた操作により細胞極性を正常に復帰させるかどうかを検証する。それと並行してGαoとSPTAN1との結合部位の同定およびDEE関連SPTAN1変異体を設計し、SPTAN1フラグメントおよびDEE型変異を有するSPTAN1とGαoとが物理的に相互作用し分子シグナルをどのように変化させるかを明らかにするために生化学実験を行う。

在本研究中，我们将重点关注发育性癫痫性脑病（DEE）相关基因 GNAO1 和 SPTAN1，并分析这些基因下游存在的分子信号如何在发育阶段调节神经元生长锥。特别是，通过分析GNAO1下游存在的钙依赖性信号对生长锥的影响，我们将阐明GNAO1如何调节神经元的功能极性，并最终发现新的治疗靶点。 2022年，我们将使用SiRNA敲低Gnao1的Neuro-2a细胞进行免疫荧光免疫分析，并使用共聚焦激光测量神经突和生长锥中Gnao1蛋白（Gαo）和其他细胞骨架蛋白的表达谱。使用显微镜进行分析。接下来，使用由人 iPS 细胞建立的类器官，我们比较了正常对照、GNAO1 敲除和患病儿童来源 (G203R) 的脑类器官内或从脑类器官分离的单层神经元生长锥中 Gαo 和细胞骨架蛋白的表达。 。我们还通过使用神经元的 RNA-seq 分析来寻找 GNAO1 下游的分子信号。未来，我们将进行生化实验来鉴定与GNAO1相关的分子信号，并测试特定抑制剂或核酸衍生物的操作是否可以恢复正常的细胞极性。同时，我们将鉴定Gαo和SPTAN1之间的结合位点并设计DEE相关的SPTAN1突变体，以及带有SPTAN1片段和DEE型突变的SPTAN1如何与Gαo物理相互作用并改变分子信号，我们将进行生化实验来找出答案。 。